IL CITOSCHELETRO E LA MOBILITA’ CELLULARE

1. IL CITOSCHELETRO E LA MOBILITA’ CELLULARE

2. Sistema di filamenti che svolge funzioni spaziali e meccaniche nella cellula CITOSCHELETRO: • media l’organizzazione spaziale delle cellule • ne mantiene la forma corretta • permette i cambiamenti di forma e il movimento (es. spermatozoi) • media il riarrangiamento dei componenti interni durante la crescita e la divisione cellulare • esercita una trazione sui cromosomi allontanandoli durante la mitosi • taglia la cellula in divisione in due • spinge e guida il traffico intracellulare di organelli • sostiene la membrana plasmatica • guida la crescita della parete cellulare vegetale Le diverse funzioni del citoscheletro si basano sul comportamento di tre famiglie di proteine che si assemblano a formare tre tipi principali di filamenti; ciascun tipo di filamenti ha proprietà meccaniche distinte e una dinamica diversa, ma certi principi fondamentali sono comuni a tutti.

3. Tre tipi di filamenti del citoscheletro sono comuni a molte cellule eucariotiche: Filamenti intermedi:forniscono forza meccanica e resistenza agli stress Microtubuli:determinano le posizioni degli organelli e dirigono il trasporto intracellulare Filamenti di actina: determinano la forma della superficie cellulare e sono necessari per la locomozione dell’intera cellula Proteine accessorie: sono essenziali per l’assemblaggio controllato dei filamenti del citoscheletro, comprendono i motori proteici che muovono gli organelli o i filamenti stessi. Differenze nelle forze che tengono unite le subunità determinano differenze cruciali nella stabilità e nelle proprietà meccaniche dei singoli filamenti.

4. I polimeri del citoscheletro combinano forza con adattabilità perché sono costituiti da PROTOFILAMENTImultipli, lunghe file di subunità unite per le estremità, che si associano fra loro lateralmente.

5. Assemblaggio di subunitàin un aggregato iniziale (o nucleo) Stabilizzazione dei contatti subunità-subunità Allungamento del polimero per aggiunta di altre subunità Le subunità in un filamento del citoscheletro sono tenute insieme da interazioni idrofobiche e legami non covalenti deboli; le posizioni e i tipi di contatti sono diversi per i diversi filamenti. Processo diNucleazione

6. NUCLEAZIONE: • la polimerizzazione dipende dalla concentrazione di subunità non polimeriche • Concentrazione critica: quando il tasso di associazione e dissociazione si equivalgono • Punto stazionario • proteine speciali per catalizzare la nucleazione dei filamenti in siti specifici, determinando la posizione in cui si assemblano nuovi filamenti del citoscheletro POLARITA’ DEI FILAMENTI DEL CITOSCHELETRO: • i filamenti, rispetto ai tassi di polimerizzazione e depolimerizzazione, sono strutture polari • il terminale con il tasso di polimerizzazione maggiore è detto terminale (+) (“plus end”) • il terminale con il tasso di polimerizzazione minore è detto terminale (- )(“minus end”)

7. VELENI CHE AGISCONO SUI FILAMENTI DEL CITOSCHELETRO: • COLCHICINA inibisce l’assemblaggio microtubulare e promuove la depolimerizzazione di microtubuli preesistenti • TAXOLOspinge l’equilibrio eterodimeri/microtubuli verso la forma polimerica dei microtubuli • VINBLASTINA e VINCRISTINAlegano gli eterodimeri di tubulina in grandi aggregati paracristallini spingendo l’equilibrio verso la depolimerizzazione • FALLOIDINA lega i filamenti di actina e li stabilizza • LATRUNCULINA lega i monomeri di actina e li stabilizza

8. FILAMENTI INTERMEDI • Presenti soltanto in alcuni metazoi, fra i quali vertebrati, nematodi e molluschi • anche in questi organismi non sono, comunque, necessari in tutte le cellule • correlati alle lamine nucleari (proteine filamentose che formano un reticolo che ricopre la membrana interna dell’involucro nucleare, antenati dei filamenti intermedi) • impartiscono forza fisica a cellule e tessuti • Strutture dinamiche, la fosforilazione regola probabilmente il disassemblaggio. • Famiglie diverse di filamenti intermedi, la più diversificata è quella delle CHERATINE, • Una seconda famiglia è costituita dai NEUROFILAMENTI

9. Monomeri: molecole filamentose con dominio centrale esteso ad a-elica. Dimeri: il dominio a-elica di due monomeri forma un coiled coil parallelo. Tetramero: una coppia di dimeri si associa in modo antiparallelo e sfalsato. Il tetramero rappresenta la subunità solubile. Protofilamento: i tetrameri si uniscono insieme lateralmente. Filamento: associazione di 8 protofilamenti paralleli. il filamento intermedio assemblato è privo di polarità strutturale Ogni filamento intermedio ha una sezione trasversale di 32 singoli avvolgimenti ad a-elica

10. MICROTUBULI • sono strutture altamente conservate in tutte le cellule eucariotiche • possono riarrangiarsi rapidamente a formare il fuso mitotico, durante la divisione cellulare, a ciglia e flagellio a “binari cellulari” per il trasporto di molecole • strutture cilindroidi, non ramificate, con un diametro esterno di circa 25 nm ed un canale centrale aperto • sono costituiti da subunità proteiche globulari di TUBULINAche si associano a formare dei protofilamenti • 13 protofilamenti paralleli si associano a costituire il microtubulo (struttura elicoidale regolare)

11. LA TUBULINA: • Costituisce le subunità sferiche dei microtubuli • è un eterodimero formato da due proteine globulari strettamente correlate: -TUBULINA e -TUBULINA, unite da legami non covalenti • ciascun monomero ha un sito di legame per una molecola di GTP • gli eterodimeri si allineano testa-coda longitudinalmente e costituiscono il protofilamento, costituito da subunità che puntano tutte nella stessa direzione (anche i protofilamenti sono allineti allo stesso modo) POLARITA’ STRUTTURALE • 13 protofilamenti si associano a formare il microtubulo cavo • Coppie o triplette di microtubuli, costituite da un microtubulo completo e da una o due strutture incomplete a forma di C, nei flagelli e ciglia eucariotiche (coppie) e nei centrioli o corpi basali (triplette).

12. LA POLIMERIZZAZIONE DELLE TUBULINE: • i microtubuli si formano da un pool citoplasmatico di eterodimeri. • equilibrio finemente bilanciato • i dimeri di tubulina in forma libera legano il GTP (in ciascun eterodimero, una molecola di GTP si lega all’ -TUBULINA, mentre una seconda alla -TUBULINA) • il legame del GTP induce un cambiamento conformazionale dell’eterodimero che favorisce la polimerizzazione (spostamento dell’equilibrio) • l’idrolisi del GTP avviene dopo che si è instaurato il legame tra gli eterodimeri nel polimero • l’idrolisi del GTP non è necessaria per la polimerizzazione.

13. Sia actina che tubulina possono idrolizzare i nucleotidi che hanno legato; per le subunità libere, questa idrolisi procede molto lentamente, ma è accelerata quando le subunità sono incorporate nei filamenti. Allo stato stazionario molti dei singoli filamenti di una data popolazione sembrano incrementare o diminuire significativamente la loro lunghezza (velocità di allungamento molto minore di quella di accorciamento). INSTABILITA’ DINAMICA: Dipende dall’integrità strutturale del “cappuccio” di subunità, recanti il nucleotide non idroizzato, posto al terminale (+) del microtubulo. Se il cappuccio è completo, l’associazione eterodimerica è favorita (conformazione favorevole) Se l’idrolisi del GTP procede così velocemente da lasciare esposte subunità con GDP legato, al terminale (+), qui si instaura una depolimerizzazione

14. INSTABILITA’ DINAMICA:

15. TREADMILLING: Allo stato stazionario è possibile che le subunità tubuliniche fluiscano lungo il microtubulo; gli eterodimeri che si associano al terminale (+) vengono spinti verso il terminale (-) dalla continua associazione di subunità al terminale in crescita.

16. FILAMENTI DI ACTINA • sono formati da subunità compatte e globulari di ACTINA • le subunità si assemblanotesta-coda formando filamenti con una polarità strutturale distinta • ciascuna subunità ha un sito di legame per un nucleotide: ATP (o ADP) • filamento di actina è composto da due protofilamenti paralleli che si avvolgono l’uno sull’altro dando un’elica destrogira • sono filamenti più flessibili • possono essere uniti in senso trasversale da una varietà di proteine accessorie che aumentano la forza e stabilità delle strutture • formano molti tipi di proiezioni della superficie cellulare, sia dinamiche (lamellipodi e filopodi), che stabili (fasci regolari di stereociglia) • dentro le cellule formano disposizioni stabili che permettono alcuni movimenti (contrazione del muscolo)

17. NUCLEAZIONE DEI FILAMENTI DI ACTINA • La nucleazione dei filamenti di actina avviene alla membrana plasmatica • nella corteccia cellulare determinano la forma e il movimento della superficie cellulare • la nucleazione è spesso regolata da segnali esterni ed è catalizzata da complessi proteici diversi • la stabilizzazione o destabilizzazione è mediata dall’interazione con proteine accessorie (es. MAP per i microtubuli, cofilina per actina)

18. Proteine accessorie: profilina e timosina

19. I filamenti del citoscheletro possono organizzarsi in strutture di ordine superiore: • I filamenti intermedi formano legami crociati e si associano in fasci molto forti; associazione mediata anche da proteine come la filaggrina(forma fasci di filamenti di cheratina), la plectina(forma fasci di vimentina)… • i filamenti di actina possono organizzarsi con proteine che formano fasci (legami crociati tra filamenti di actina)e proteine che formano gel(tengono insieme due filamenti di actina angolati tra loro)

20. Altre proteine accessorie: filamina,fimbrina e -actinina

21. Altre proteine accessorie: gelsolina

22. CENTRI CELLULARI DI ORGANIZZAZIONE DEI MICROTUBULI (MTOC):

23. CENTRI CELLULARI DI ORGANIZZAZIONE DEI MICROTUBULI (MTOC): Nei siti intracitoplasmatici, dove i microtubuli vengono assemblati in quantità cospicue, è possibile identificare del materiale elettron-denso più o meno struttrato, che costituisce siti specializzati nell’organizzazione dei microtubuli, detti: centri cellulari di organizzazione dei microtubuli (MTOC). Ne esistono 4 tipi principali: CENTRI CELLULARI(o centrosomi o materiale pericentriolare) addensamenti di materiale elettron-denso situati nelle vicinanze del nucleo, organizzano i microtubuli citoplasmatici e i microtubulidel fuso mitotico che da questo si estendono in una conformazione “astrale”, a stella. Un centrosoma è composto da una matrice del centrosoma fibrosa che contiene più di 50 copie di g-TuRC Complesso ad anello di g-tubulina

24. Immersa nel centrosoma si trova una coppia di strutture cilindriche disposte ad angolo retto fra loro; questi sono i 2. CENTRIOLI (o corpi basali) da cui prendono origine i microtubuli dei flagelli eucariotici; i centrioli organizzano la matrice del centrosoma assicurando la sua duplicazione durante ciascun ciclo, quando si duplicano i centrioli stessi. Un centriolo è un corto cilindro di microtubuli modificati con un elevato numero di proteine accessorie. Altre strutture appartenenti alla classe dei MTOCsono: 3. CINETOCORI, strutture lamellari poste sulla superficie dei cromosomi, alle quali aderiscono i microtubuli del fuso mitotico 4. CORPI POLARI DEL FUSO, dense strutture a lamelle sovrapposte dalle quali prendono origine i microtubuli del fuso mitotico di molte cellule fungine.

25. PROTEINE MOTRICI • Motori molecolari che si associano ad un filamento del citoscheletro e usano l’energia derivata dall’idrolisi dell’ATP per muoversi in modo costante lungo di essi • diverse per il filamento a cui si attaccano, per la direzione in cui si muovono e per il cargo che portano • possono trasportare organelli (es mitocondri), fanno scivolare i filamenti del citoscheletro l’uno sull’altro • si associano ai filamenti del citoscheletro tramite un dominio motore che si lega all’ATP e lo idrolizza • dopo aver svolto l’azione motoria possono staccarsi dal filamento.

26. PROTEINE MOTRICI ASSOCIATE AI FILAMANTI DI ACTINA MIOSINA: • prima proteina motrice identificata • responsabile della generazione della forza per la contrazione muscolare • esistono diversi tipi di miosina, differenti per strutture e tessuto in cui sono presenti; • la più diffusa è quella del muscolo scheletrico, detta miosina II.

27. MIOSINA II • Proteina allungata formata da 2 catene pesanti e 2 copie di 2 tipi di catene leggere. • Ogni catena pesante ha un dominio di testa globulare all’N-terminale (motore) e una lunga sequenza aa che forma un coiled-coil (media la dimerizzazione). • Le 2 catene leggere si legano vicino alle teste. • Le code possono formare un fascio con altre molecole di miosina (interazioni coda-coda= filamenti spessi bipolari) • interazione con filamenti di actina (filamenti sottilinel muscolo scheletrico) mediante le teste CONTRAZIONE MUSCOLARE

28. FILAMENTI SPESSI: interaziona coda-coda di miosina II

29. SCIVOLAMENTO DEI FILAMENTI DI ACTINA MEDIATO DA MIOSINA • ATTACCATA: testa di miosina priva del nucleotide, è saldamente attaccata ad un filamento di actina (configurazione rigor). In un muscolo che si contrae attivamente questo è un periodo molto breve. • RILASCIATA: legame dell’ATP sul “retro” causa un immediato cambio conformazionale. Diminuisce affinità della testa per l’actina e c’è un distacco da questa. • ARMATA: si ha l’idrolisi dell’ATP con un altro cambio conformazionale dela miosinaII, che “scatta in avanti”. ADP e Pi sono ancora attaccati alla miosinaII. • GENERAZIONE DELLA FORZA: un debole legame della miosina all’actina induce il distacco del Pi, e si rafforza il legame actina-miosinaII. La testa della miosinaII torna così alla conformazione iniziale con erdita dell’ADP.

30. FIBRE MUSCOLARI Disco Z: all’estremità del sarcomero, sito di attacco per le estremità+ dei filamenti sottili. Linea M: è la posizione di proteine che collegano filamenti adiacenti di miosina fra loro. Banda A: marca la posizione dei filamenti spessi.

31. PROTEINE MOTRICI ASSOCIATE AI MICROTUBULI DINEINA CHINESINA

32. PROTEINE MOTRICI ASSOCIATE AI MICROTUBULI CHINESINA • proteina motrice identificata nell’assone gigante di seppia • composta da 2 catene pesanti e 2 leggere, 2 domini motori globulari di testa e un coiled-coil allungato (dimerizzazione) • coinvolta nel trasporto anterogrado (trasporto assonale veloce) di molecole (RE), dal corpo cellulare, verso la terminazione dell’assone

33. composta da 2 catene pesanti e 2 leggere, 2 domini motori globulari di testa e un coiled-coil allungato (dimerizzazione)

34. CONFRONTO TRA CHINESINA E MIOSINA NEL MOVIMENTO 1- INIZIO: testa anteriore della chinesina attaccata al microtubulo, testa posteriore staccata e associata ad ADP. 2- ATTACCO DELL’ATP alla testa anteriore provoca lo spostamento in avanti della testa posteriore che prende contatto con il microtubulo. 3-RILASCIO DI ADP dalla seconda testa (ex posteriore) e IDROLISI DI ATP sulla prima testa (ex anteriore) che si stacca.

35. PROTEINE MOTRICI ASSOCIATE AI MICROTUBULI DINEINA • Famiglia di motori dei microtubuli • composte da 2 o 3 catene pesanti (comprendono il dominio motore) e un numero grande e variabile di catene leggere associate • si muovono verso l’estremità (-) dei microtubuli • coinvolte nel trsaporto retrogrado di molecole (Golgi) dalla terminazione, verso il corpo cellulare del neurone

36. DINEINE: Dineine citoplasmatiche: omodimeri di catene pesanti con 2 grandi domini motori come teste Dineine assonemali: eterodimeri ed eterotrimeri con 2 o 3 domini di testa; coinvolte nello spostamento veloce di microtubuli nelle ciglia

37. MODELLO PER L’ATTACCO DI DINEINA AD UN ORGANELLO La dineina richiede l’associazione con dinactina(complesso proteico che comprende un filamento simile all’actina che interagisce con complessi proteici presenti sulle membrane degli organelli) per svolgere la sua funzione

38. EFFETTO DELLA DEPOLARIZZAZIONE DEI MICROTUBULI SUGLI ORGANELLI CITOPLASMATICI ROSSO= microtubuli VERDE= Golgi

39. ESEMPI: Movimenti regolati dai melanosomi in cellule pigmentate di pesce:

40. Ciglia e flagelli Dineina cigliare

41. MOVIMENTI MEDIATI DALLA CORTECCIA DI ACTINA PROTRUSIONE ATTACCO TRAZIONE

42. Organizzazione dei microtubuli in fibroblasti e neuroni