Proteine del sistema immunitario e del sistema nervoso centrale

1. Proteine del sistema immunitario e del sistema nervoso centrale

2. Catene leggere (L) e pesanti (H) CL VL hinge CH1 VH CH2 • La struttura della molecola è garantita da: • Interazioni non covalenti tra domini Ig • Ponti disolfuro tra L e H e tra le regioni C di H (cerniera) CH3

3. Struttura generale di un anticorpo Riconoscimento dell’antigene e funzioni effettrici: funzioni spazialmente separate e indipendenti

4. Il dominio immunoglobulinico • ≈ 110 a.a. che ripiegano in maniera indipendente • 2 strati di foglietto β planare (β sandwich) • ciascuno composto da 3-5 β-strands (5-10 a.a.) antiparalleli motivo a chiave greca • Stabilizzato da: • ponti disolfuro • interazioni idrofobiche tra i due foglietti β • Conservazione di specifici residui (es. Cys e Trp)

5. La superfamiglia delle immunoglobuline Ab • tutte le molecole che contengono il dominio Ig; mediano funzioni di riconoscimento, adesione e legame • omologia di sequenza • tutti i geni che codificano per domini Ig si sono evoluti da un gene ancestore comune • Evento precoce: duplicazione genica, con divergenza esoni V e C. Evoluzione: 1) Divergenza “V e C” e TCR (sequenza). 2- Capacità di riarrangiare il DNA (per riconoscimento Ag) • La funzione dipende dall’interazione tra domini Ig MHC TCR

6. C e V in catene leggere (L) e pesanti (H) V= N-term C= C-term H: V → 1 dominio C → 3 o 4 domini L: V → 1 dominio C → 1 dominio V: la sequenza a.a. differenzia gli Ab prodotti da un clone di linfociti B

7. Segmenti ipervariabili o CDR Complementarity Determining Region: ≈ 10 a.a. CDR3 il più variabile N-term C-term

8. Regioni ipervariabili o CDR Le CDR formano delle anse esposte sulla superficie, strutture chimiche uniche → SPECIFICITA’ Sequenze conservate adiacenti → ripiegamenti del dominio Ig

9. IgM e IgA formano polimeri • IgM e IgA possono formare multimeri • Le IgM formano pentameri nel plasma • Le IgA formano dimeri nelle secrezioni mucose (necessario per il trasporto attraverso gli epiteli) • Contengono una coda C-term di 18 a.a. con un residuo Cys necessario alla polimerizzazione • Un polipeptide aggiuntivo (J: joining) di 15 kDa favorisce la polimerizzazione legando la Cys

10. Classi o isotipi delle Ig • 2 classi (o isotipi), che si differenziano per la regione C-term della catena leggera: • κ • λ • Ogni molecola anticorpale possiede o 2κ o 2λ • Cκ e Cλ sono omologhe tra loro e omologhe a Vκ e a Vλ • Non sono note differenze funzionali • 60% κ e 40% λ nell’uomo

11. Sito di legame per l’antigene Ag VL+ VH 2 per ogni molecola di anticorpo VL VH Ab

12. Legame all’antigene • La flessibilità degli anticorpi (grazie alla regione CERNIERA) permette il legame a porzioni di antigeni multivalenti distanti • Cerniera: ≈ 10/60+ a.a. • La sequenza assume una conformazione casuale; la molecola fa una torsione tra CH1 E CH2 • La flessibilità è influenzata anche dalla capacità di VH di ruotare attorno a CH1

13. Legame all’antigene • Legame reversibile e non covalente • Il contributo di ciascuna forza dipende dalla struttura del sito di legame e da quella del determinante antigenico AFFINITA’: • forza di legame tra un singolo sito combinatorio e un epitopo antigenico. Si esprime come costante di dissociazione (Kd). Tra 10-7 e 10-11 M. AVIDITA’: • forza di legame complessiva tra Ag e Ab (aumento geometrico) (rilevante per IgM)

14. L’Ab come Ag • isotipi: Riconosciute da Ab anti-isotipo le immunoglobuline dello stesso isotipo di una specie • allotipi: L’Ab riconosce in modo specifico solo alcune Ig dello stesso isotipo della stessa specie. Le differenze sono dovuti a diversi alleli per la regione C (polimorfismi) • idiotipi: L’Ab riconosce in modo specifico la regione V dell’Ig

15. Introduzione: l’MHC • MHC I e II sono strutturalmente differenti ma omologhe • Sono i geni più polimorfi • Sono espressi in modo codominante • Espresso su tutte le cellule nucleate (costitutivamente) • Riconosciuto da CD8+ • Espresso sulle APC (potenziato da citochine) • Riconosciuto da CD4+

16. MHC di classe I • Eterotrimero; 2 catene polipeptidiche associate non covalentemente: una catena α, codificata nell’MHC e la catena β2-microglobulina non codificata nell’MHC + peptide N-term: α1 e α2 90 a.a., tasca di legame per il peptide ¾ extracellulare Il segmento α3 si ripiega a formare un dominio Ig (sequenza conservata): sito di legame per il CD8 β2 25 a.a. idrofobici: attraversamento del bilayer lipidico 30 a.a. basici, interazione con i gruppi fosfolipidici: ancoraggio alla membrana L’espressione in membrana richiede i 3 componenti→i legami si rafforzano β2-microglobulina: interagisce con α3, strutturalmente omologa ad un dominio Ig, non varia tra le molecole MHC I

17. MHC I: tasca di legame per il peptide • α1 e α2 interagiscono tra loro e formano una piattaforma di 8 nastri antiparalleli di foglietto β che sostengono 2 α-eliche • I residui polimorfi di MHC I sono confinati in α1 e α2 • La tasca ospita un peptide (anche le terminazioni) di 8-11 aminoacidi in conformazione flessibile estesa. Le estremità del cleft sono chiuse e peptidi più grandi non riescono ad entrarvi • C-term del peptide: residui idrofobici o acidi • Le interazioni non covalenti avvengono tra residui del peptide e dell’MHC (foglietto β e α-eliche), spesso sono interazioni idrofobiche nelle “nicchie” del foglietto β e i residui àncora (1 o 2 per peptide)

18. MHC di classe II • Eterotrimero: 2 catene polipeptidiche associate non covalentemente: una catena α (32-34 kDa) e una catena β (29-32 kDa), entrambe codificate nell’MHC (polimorfi) + peptide N-term: α1 e β1 contengono i residui polimorfi, tasca di legame per il peptide • α2 e β2 formano domini Ig e non variano tra i vari alleli di classe II • 25 a.a. idrofobici, regione transmembrana • a.a. basici, e coda idrofilica • β2: sito di legame per CD4 • Le catene α di un locus (es. DR) si appaiano con catene β dello stesso locus (DR)

19. MHC II: tasca di legame per il peptide • 4 nastri di foglietto β +1 α-elica: α 1 • 4 nastri di foglietto β +1 α-elica: β 1 • I residui polimorfi di MHC II sono confinati in β 1 • Le estremità della tasca sono aperte: vengono ospitati peptidi di lunghezza anche > 30 a.a. (lungh. ideale 12-16 a.a.) • Diversi ponti ionici e ponti H con le α-eliche • Le interazioni non covalenti avvengono tra residui del peptide e dell’MHC II; non tutti i peptidi hanno residui àncora

20. MHC di classe I e II: struttura Ogni individuo eterozigote esprime su tutte le cellule mononucleate 6 MHCI diversi: catene α codificate dai 2 alleli dei geni HLA-A, HLA-B e HLA-C Il numero totale di molecole MHCII espresse è 10-20, per gli appaiamenti eterologhi (es. DRα di un cromosoma con DRβ dell’altro)

21. MHC di classe I e II: CDR

22. MHC di classe I e II: legame al peptide MHC classe I MHC classe II • I peptidi e le molecole d’acqua associate riempiono interamente la tasca • Differenti alleli favoriscono il legame di peptidi diversi (e quindi la possibilità di presentarli ai linfociti T) • Al riconoscimento antigenico (TCR) contribuiscono: residui esposti del peptide → specificità residui dell’MHC → restrizione MHC Potenziale elettrostatico: positivo, negativo

23. Interazione peptide-MHC Una proteina per evocare una risposta immunitaria deve contenere peptidi che possano legarsi alle molecole MHC • Le molecole MHC mostrano promiscuità; la specificità viene garantita dal TCR • Le molecole MHC non distinguono tra self e non-self; la sorveglianza è data dai linfociti T • I peptidi hanno in comune caratteristiche strutturali (es. lunghezza) • l’interazione è saturabile a bassa affinità (Kd= koff /kon ≈10-6 M con kon e koff basse, per avere un’interazione che permette l’interazione con il TCR)

24. Introduzione: TCR • Recettore per l’antigene dei linfociti T helper (CD4+) e citotossici (CD8+) • Eterodimero costituito da due catene transmembrana, α e β, legate covalentemente (S-S) • La parte esterna è simile al Fab: TCR e Ab sono strutturalmente simili MA: • Il TCR non viene prodotto in forma solubile • Il TCR è monovalente • Non svolge autonomamente funzioni effettrici • Non esiste lo scambio isotipico (C non cambia) • Non esiste la maturazione dell’affinità (non ci sono mutazioni somatiche nelle regioni V)

25. Organizzazione dei geni del TCR 1) Ricombinazione somatica 2) Diversità giunzionale 3) Inserzione della regione N

26. Introduzione: TCR • Dominio Ig variabile (V) • Dominio Ig costante (C) • Regione cerniera con Cys • Regione idrofobica transmembrana con presenza di Lys (α) e Lys e Arg (β) per interazione con CD3 e ζ • Breve regione citoplasmatica (5-12 a.a.) troppo breve per trasdurre il segnale (CD3, ζ, CD28...)

27. Differenze rispetto alle Ig • Cα non è un vero dominio Ig: la metà che si rivolge al Cβ forma un foglietto β (simile a Ig), l’altra metà contiene β strands non impaccati e un segmento di α elica • Il legame tra Cα e Cβ è dovuto anche ai carboidrati su Cα (legami H con foglietto β di Cβ) • Forma simile a una Ig ma più corta e larga • Maggiore flessibilità tra C e V perché porzione più estesa • Vα→VL e Vβ→VH • Alcune differenze di orientamento nei CDR

28. Riconoscimento dell’MHC-peptide

29. Riconoscimento dell’MHC-peptide • Il riconoscimento è mediato dalle CDR della catena α e β, in cui si concentra la variabilità • 3 CDR della catena α si giustappongono a 3 CDR della catena β (β : una quarta CDR per il riconoscimento dei superantigeni), superficie planare • CDR3 la più variabile è posizionata in corrispondenza del centro del peptide legato all’MHC • CDR1 e CDR2 contatto con l’MHC CDR3 CDR4 CDR1 e 2 CDR1 e 2 • L’affinità del TCR per MHC/peptide è bassa (Kd 10-5-10-7; Ag/Ab Kd fino a 10-11 M); l’emivita 1-10s. Per questo sono necessarie le molecole accessorie per avere una risposta biologica MHC

30. Riconoscimento del superAg • I superAg stimolano tutti i linfociti T che esprimono una determinata regione Vβ nel loro TCR (non sono mitogeni ma nemmeno Ag comuni) • Si legano a MHC di classe II (codificati da diversi alleli), NON nella tasca di presentazione dell’Ag • Ogni enterotossina aggrega 2 MHC → 2 TCR Vβ contiene CDR4

31. I corecettori: CD4 e CD8 • Glicoproteine transmembrana della superfamiglia delle Ig • Funzione simile ma struttura diversa • Motivo per cui i T CD4+ riconoscono MHCII e CD8+ MHCI • CD4: 4 domini Ig extracellulari, una regione transmembrana idrofobica, e 38 a.a. (molti basici) citoplasmatici • Mediante D1 e D2 (N-term) si lega al dominio non polimorfo β2 dell’MHC II, D1-D2 fortemente impaccati e separati da D3-D4 da una regione cerniera D1→Ig D2 • La regione intracellulare interagisce fortemente con una tirosina chinasi Lck, per la trasduzione del segnale

32. I corecettori: CD4 e CD8 • Glicoproteine transmembrana della superfamiglia delle Ig • Funzione simile ma struttura diversa • CD8: eterodimero, 2 catene omologhe CD8α e CD8β legate da S-S • Un dominio Ig extracellulare, polipeptide esteso, una regione transmembrana idrofobica, e 25 a.a. (molti basici) citoplasmatici • La regione extracellulare è altamente glicosilata per proteggere il CD8 dall’attacco delle proteasi e per mantenerlo esteso • Il dominio Ig interagisce con il dominio non polimorfo α3 di MHC I • La regione intracellulare interagisce fortemente con una tirosina chinasi Lck, per la trasduzione del segnale

33. I corecettori: CD4 e CD8

34. Citochine: Caratteristiche generali • Piccole proteine (15-30 kDa) non anticorpali, mediatori della risposta immune e dell’infiammazione • Riconosciute da recettori (Kd 10-10-10-12 M) • Secrete da diversi tipi di cellule dell’immunità innata e acquisita

35. Citochine: Caratteristiche generali • Pleiotropismo: prodotte da diverse cellule e attive su diversi tipi cellulari • Ridondanza: azioni simili • - possono condividere R o parti di R • - difetti in un componente unico: piccolo effetto • - difetto in componenti condivisi: grande effetto (es. IL-2Rγ SCID severe combined immunodeficiency) • Influenzano sintesi e azione di altre citochine - antagonismo/sinergia/effetti additivi

36. Citochine: Caratteristiche generali • La loro secrezione è un evento di breve durata e auto-limitato • - non immagazzinate • - espressione in seguito a stimolazione (mRNA con breve emivita) • La loro azione può essere locale (autocrina o paracrina) o sistemica • L’espressione dei recettori per citochine è regolata • - risposta solo dei linfociti Ag-specifici • - la citochina stessa può aumentare o diminuire l’espressione del suo R • Agiscono modificando l’espressione genica nelle cellule bersaglio • - eccezioni: chemochine e TNF

37. Classificazione funzionale • Citochine dell’immunità innata • Prodotte soprattutto dai fagociti mononucleati • Possono essere prodotte anche nell’ambito della risposta immune specifica • Alimentano reazioni infiammatorie precoci • Citochine dell’immunità specifica • Prodotte soprattutto dai linfociti T • Funzione regolatrice sulla crescita/differenziamento delle popolazioni linfocitarie • o • Reclutamento di cellule effettrici specializzate (es. neutrofili) • Citochine ad attività emopoietica • Prodotte da cellule stromali del midollo osseo, leucociti ed altri tipi cellulari • Funzione regolatrice sulla crescita/differenziamento dei leucociti immaturi

38. Recettori per le citochine • 5 diverse famiglie (struttura comune): • Recettori di tipo 1 (dell’IL-2 o dell’emopoietina) • -1 o + domini con coppia di Cys conservate e sequenza prossimale alla membrana WSXWS • -lega molecole con ripiegamento 4-helix bundle • - struttura multimerica , indotta dal legame del L (1 catena per interazione con L e 1o+ per trasduzione del segnale→spesso condivise tra + recettori) • mancano di attività Tyr chinasica intrinseca • 3 subset in base alla loro capacità di legare uno dei 3 elementi comuni: gp130, common beta, and common gamma

39. Recettori per le citochine • Recettori di tipo 2 (degli interferoni) • - residui di Cys conservati • - struttura multimerica (1 catena per interazione con L e 1o+ per trasduzione del segnale) • - R per IFN-alpha, IFN-beta, IFN-gamma, IL10, IL22 • - hanno attività protein-chinasica intrinseca

40. Recettori per le citochine • Recettori per TNF • Superfamiglia delle Ig • Recettori a 7 α-elica transmembrana (recettori per le chemochine) e accoppiati a proteine G

41. Mediatori della immunità innata • TNFα • IL-1 • IL-10 • IL-12 • INTERFERONI di tipo 1 (IFNα, IFNβ) • IFNγ • CHEMOCHINE

42. TNF omotrimero TNF / TNFR (monomero) TNF-α • Prodotto da macrofagi attivati • Mediatore dell’infiammazione acuta in risposta a microrganismi (gram-) • Media il reclutamento di neutrofili e macrofagi nel sito dell’infiammazione (↑ICAM endotelio) • Agisce sull’ipotalamo (febbre) • Promuove la produzione delle proteine della fase acuta (fegato) R per TNF β-jellyroll

43. TNF-α Death domain

44. IL-1 • Effetti simili a TNF α • Prodotta da macrofagi attivati • Agisce soprattutto su linfociti T (al confine tra immunità innata e acquisita) Beta-trifoglio: struttura 12 beta-strands R: superfamiglia delle Ig

45. IL-1

46. IL-10 • Citochina inibitoria: • Inibisce la produzione di IFNγ dalle Th1 e produce lo shift verso Th2 • Inibisce la produzione di altre citochine dai macrofagi attivati • Inibisce la produzione di MHCII e altre molecole co-stimolatorie sui macrofagi • Prodotta da macrofagi attivati e Th2 • Agisce nell’immunità innata e acquisita IL-10 (Inter-subunit dimeric 4-helix bundles) IL-10Rα R di tipo II

47. IL-10 La trasduzione avviene solo in presenza di entrambe le catene del R

48. IL-12 • Prodotta da macrofagi attivati e cellule dendritiche • Stimola la produzione di IFNγ • Induce il differenziamento dei Th verso Th1 • Aumenta le capacità citotossiche dei CTL e NK • IL-12 è un eterodimero (p40 e p35 legate covalentemente) • Il recettore è formato da due catene (R di tipo I) • La trasduzione del segnale usa la via JAK/STAT

49. IFN-α e β • IFN-α prodotta da fagociti mononucleati IFN-β da diversi tipi di cellule (fibroblasti) • Inibisce la replicazione virale nelle cellule • Aumenta l’espressione di MHCI • Attiva le cellule NK Inter-subunit dimeric 4-helix bundles R di tipo II

50. IFN-α e β