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Giovana Giacomini

Giovana Giacomini. Introdução. Trypanosoma cruzi. Fase aguda Fase indeterminada Fase crônica. Doença de Chagas. 10 milhões. Introdução. Trypanosoma cruzi. Grande diversidade genética classificação RAPD ( random amplified polymorphic DNA )

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Presentation Transcript

  1. Giovana Giacomini

  2. Introdução Trypanosoma cruzi Fase aguda Fase indeterminada Fase crônica Doença de Chagas 10 milhões

  3. Introdução Trypanosoma cruzi • Grande diversidade genética classificação • RAPD (random amplified polymorphic DNA) • MLEE (multilocus enzyme eletrophoresis) • DTU (discrete typing unit) • conjuntos de unidades populacionais geneticamente mais relacionadas entre si do que • qualquer com outra população • 6 DTUs • Emergência de DTUs: recombinação IIa e IIc = I + IIb • IId e IIe = IIb + IIc TCI TCII IIa, IIb, IIc, IId e IIe

  4. Introdução Identificação dos DTUs é de alta relevância para estudos clínicos e epidemiológicos Exploração de possíveis ligações entre diversidade genética X pleomorfismo na severidade e sintomas Rastreamento molecular de populações silvestres Método discriminatório molecular simples e sensível

  5. Objetivo • Aplicar a análise MLP à 12 loci gênicos • Genes envolvidos na relação hospedeiro-parasita devido a possível propensão à polimorfismos como uma resposta adaptativa à pressão seletiva imune • Comparação com resultados obtidos por RAPD (validação taxonômica) e MLEE (aplicações práticas) • Prova de evidência para aplicabilidade

  6. Materiais e Métodos 20 cepas de T. cruzi Amostras de sangue: 10 humanas e 21 outros mamíferos Amostras do conteúdo intestinal: 19 Mepraia spinolai

  7. Materiais e Métodos 12 genes GenBank: sequências correspondentes Primer Premier PCR

  8. Materiais e Métodos PCR-RFLP (Polymerase Chain Reaction Restriction Fragment-Length Polymorfism) Avaliar a diferença nas sequências de DNA Clivagem por enzimas de restrição (Webcutter) Separação dos fragmentos Produto da PCR Microchip (eletroforese capilar) Eletroforese em gel de agarose

  9. Materiais e Métodos 1ª etapa: 6 cepas T. cruzi e T. cruzi marinkellei (“7-strain analysis”) Análise final: 1 enzima por marcador

  10. Resultados 1ª etapa: 7-strain analysis 2ª etapa: 20 cepas gp72 (TaqI) genótipos heterozigotos 1f8 (Alw21I) Sobreposição dos padrões dos supostos ancestrais

  11. Resultados Polimorfismos entre DTUs Fragmentos únicos DTUs específicos Combinações de características únicas

  12. Resultados Polimorfismos intra-DTUs gp63 (TaiI)

  13. Resultados Aplicação do PCR-RFLP em amostras de hospedeiros 1f8/Alw21I IIa IIc IIa IIc + I IId IIe + I IId IIe + IIb IId IIe + I IIb IIb

  14. Conclusões • Concordância dos resultados encontrados com PCR-RFLP com a classificação baseada na MLEE e RAPD. • Algoritmo para identificação de DTUs T. cruzi. - Análise MLP representou uma nova alternativa aos métodos moleculares existente. - Simples, discriminação em vários níveis, aplicado diretamente para amostras dos hospedeiros. - Ferramenta importante para estudos epidemiológicos e ações de controle.

  15. Segunda Reunião Satélite – XXXVI Reunião Anual em Pesquisa Básica sobre a Doença de Chagas (Búzio, RJ – 2009) Fonte: Zingaleset al., 2009

  16. OBRIGADA!!!

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