Experimentální metody bioenergetiky

1. Experimentální metody bioenergetiky 4.ročník biochemie

2. Spektroskopické metody - cytochromy po redukci cytochromu pouze jedno maximum * pozorovány změny v spektrech MTCH součástí při přenosech elektronů (považovány za experimentální artefakt) * problémy s měřením spekter v MTCH (vysoká nespecifická absorbce a rozptyl světla organelami)

3. Spektroskopické metody - cytochromy Příklad: úbytek absorbance při 610nm po oxidaci cyt aa3 • Diferenční spektra cytochromů • - paprsek prochází 2 kyvetami se stejným vzorkem v různém redoxním stavu • lze rozlišit komponenty cytochromů např. vazbou CO • zvýšení rozlišení a citlivosti při měření v kapalném N2 (77oK)

4. Spektroskopické metody – Fe/S centra a)nativní ISP s příd. thiosiřičitanu EPR (ESR) spektrum: interakce NO s Fe-S klusterem b)přídavek NO signál komplexu hem-NO c)přídavek NO v přít. Fe2+-citrátu (mizí signál při g=1.94) d)přídavek thiosiřičitanu (nový signál při g=2.01 a 1.97 ale neobnovuje se signál při g=1.94)

5. Spektroskopické metody - UQ EPR (ESR) spektrum: vliv -tokoferolu na ubisemichinolové radikály UQ10 1) 0.5 mM KO2 2) 0.05 mM ubiquinone-10 3) 0.5 mM KO2 + 0.05 mM ubiquinone-10 4) 0.5 mM KO2 + 0.05 mM ubiquinone-10 + 0.05 mM a-tocopherol

6. Kyslíková (Clarkova) elektroda Zavedena v 50.letech – průkaz závislosti spotřeby kyslíku na transportu ADP a Pi do mtch = respirační kontrola • nízké polarizační napětí (cca. 0.6 V) mezi Ag-anodou (+) a Pt-katodou (-). • O2 difunduje teflonovou membránou a je redukován na Pt-katodě • O2 + 4H+ + 4e-1 = 2H2O • pomalá reakce na Ag-anodě: Ag + Cl- = Ag Cl + e-1 • výsledný proud je přímo úměrný množství redukovaného kyslíku

7. Kyslíková (Clarkova) elektroda Detailní pohled na kyslíkovou elektrodu • Faktory ovlivňující difúzi kyslíku k elektrodě: • koncentrace O2 v médiu • teplota, tlouštka a propustnost membrány, viskozita, rychlost míchání • na rozdíl of pH elektrody nepracuje při rovnovážné poloze procesu • potřeba neustálé rekalibrace vůči standardu – nejčastěji kyslík • Otázka: Jak se kalibruje Clarkův článek …?

8. Určení stechiometrie H+/0 Extrapolace na hodnotu bez průsaku H+ během aerobní fáze BEN - chemi Pulsní kyslíková metoda: přídavek malého množství O2 k anaerobní suspenzi MTCH – sledování změny pH rychlou elektrodou

9. Inhibitory MTCH funkce • Typy dle cílového místa: • Inhibitory dýchacího řetězce (např. KCN, antimycin, rotenone ) • blokování dýchání v přítomnosti ADP nebo rozpojovačů • 2) Inhibitory fosforylace (např. oligomycin) • zrušení nárůstu spotřeby O2 po přidávku x bez efektu na dýchání stimulované rozpojovači • 3) Rozpojovače (např. dinitrofenol, CCCP, FCCP) • zrušení spojení dýchacího řetězce a fosforylace v intaktních MTCH . • 4) Inhibitory transportu (např. atractyloside, bongkrekát, NEM) • inhibice exportu ATP nebo import substrátů do MTCH • 5) Ionofory (např. valinomycin, nigericin) • propustnost vnitřní membrány pro neprůchozí ionty • 6) Inhibitory Krebsova cyklu (např. arsenitan, aminooxyacetát) • inhibice enzymů TCA cyklu BEN - meth

10. Určení respirační kontroly a poměru P/O Rychlost spotřeby kyslíku ve stavu 4 je obvykle vyšší než ve stavu 2 před prvním přídavkem ADP Proč? Výpočet poměru P/O z grafu: pokles konc. O2 (z grafu) = 0.135 mM objem reakční nádobky = 2.5ml O- atomy spotřebované ve stavu 3 = 0.135 * 2 * 2.5 = 0.68 . 10-6 atomů (všimněte si faktoru 2) přídavek ADP (20 l 50mM roztoku) = vytvořené ATP = celkem 1 mol P:O = [ATP ] : [O2] = 1.48 (pro oxidaci sukcinátu) Hodnota pro NADH je vyšší (cca 2.5) – Proč ??

11. Měření protonmotivní síly • Měření p – zahrnuje oddělené stanovení  a pH • Stanovení ~ rovnovážná distribuce permeabilních kationtů • na každých 60mV = 10x násobná akumulace iontů v příslušném kompartmentu (kationty v záporně nabitém apod.) • Stanovení pH~ rovnovážná distribuce permeabilních slabých kyselin • na každých 60mV= 10násobná akumulace kyseliny v basickém kompartmentu • Důležité: • minimální koncentrace použité „sondy“ • pH komponentu lze minimalizovat vysokou konc. Pi nebo nigericinem BEN - meth

12. Měření p – iontově-selektivní elektrody - nepřímé měření – koncentrace elektrolytu v externím médiu a podle odhadnutého objemu MTCH výpočet vnitřní koncentrace (Na+, K+, …)

13. Měření p – vnitřní optické indikátory • „Elektrochromismus“ • změna spektrálních vlastností membránových složek při vytvoření potenciálu  na membráně •  = 200mV odpovídá elektrickému poli cca 300 000 V cm-1 • Karotenoidy = nejvýznamnější indikátory  • - centrální hydrofóbní část s konjug. dvojnými vazbami • - velice rychlá odpověď (řádově ns) • - změny v abs. maximech do několika nm = nutnost duálních spekter • - reagují pouze na změny potenciálu v bezprostřední blízkosti molekuly • (výsledkem vyšší hodnoty než metodou distribuce iontů) BEN - meth

14. Měření p – karotenoidy

15. Měření p – vnější optické indikátory • Lipofilní kationty a anionty: • schopnost pronikat přes lipidické membrány • po dosažení Nerstovy rovnováhy lze spočítat  • Většinou fluorescenční „proby“ • - lze měřit nárůst fluorescence v matrix (př. bisoxonol) • x často jsou zároveň inhibitory MTCH součástí

16. Měření p – 31P-NMR • Přímá metoda: • Resonanční energie jádra fosforu v Pi je ovlivněna jeho protonizací • pKa pro H2PO4-/HPO42- = 6.8 …. možnost měření pH v 6-7.6 • NMR signál je průměrem signálu obou protonovaných forem • (výměna protonu je rychlá v měřítku NMRmetody) • pH lze vypočítat z konc. Pi uvnitř a vně MTCH • Nevýhody: • nízká citlivost – cca mM koncentrace Pi • vyžaduje husté suspenze MTCH x problémem s difúzí kyslíku a substrátů BEN - meth

17. Měření p - 31P-NMR 1 = MDPA, 2=fosfocholin, 3=Picyt, 4=Piext, 5=glycerofosfoetanolamin, 6=glycerofosfocholin, 8=-NDP a NTP, 9=-NDP a NTP, 10=UDPG D – 30min po perfúzi 50nM valinomycinu a 60nm nigericinu C – 30min po perfúzi 50nM valinomycinu B – 10min po perfúzi 50nM valinomycinu A – typické spektrum perfúzovaných jater

18. Děkuji vám za pozornost!