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シンプラスト経路 Symplast

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  1. 土壌水 Soil water 根 Root カスパリー線 Casparian stripe 道管 xylem シンプラスト経路 Symplast アポプラスト経路 Apoplast 細胞間連絡 (plasmodesmata) 通常は分子量1000以下 の物質が通過

  2. Casparian Strip Symplast: Solutes MUST go into the cell • 細胞(シンプラスト)に入るには問題が・・・・ •  細胞をつつむ「膜」の基本組成は脂質(油っぽい) •  「水と油」だから、水の透過性は、ほどほど・・・ H2O ドウヤッテ  ハイロウカ? Lipids 実際の細胞はとてもよく水を透過させることが多い。

  3. 水ポテンシャル 細胞レベルでは アクアポリンはここに関係(後述) Water uptake(movement/flux): Water flux*=(駆動力)×(水の動きやすさ:透過性) Driving force water permeability (*per unit time) 水ポテンシャル差 Water potential difference

  4. “Water potential” mainly consists in “concentration” and “presser” 物理的圧力(静水圧): 「Presser potential」ψp Molecular transport of water ・・・ depends on waterpotential deference 押しとどめるために必要な圧力(P) 膨張しようとする (Swelling) M ・・・「osmotic presser」   (proposal to concentration) Water molecule 「浸透圧」にマイナスをつけたもの⇒ 「Osmotic potentail」ψosm minus (osmotic pressure) 「Semi-permeable membrane」 半透膜 Water can pass but solute (M) cannnot. Why minuis?ψp+ψosm=0(釣り合っている場合)

  5. ψosm -0.1 > -0.5 ψp 0 < 0.4 + Water movement ψ -0.1 = -0.1 (ψ1 =ψ2) ψ1 ψ2 ψ1 ψ2 ψ1 ψ2 P P P ψp: 0 < 0.4 (MPa) ψosm: -0.1 > -0.5 (MPa) Water moves from high ψw to low ψw +・・・ Water potential ψw = ψosm + ψp 植物細胞では、これが 「膨圧」Turgor 1 MPa ≈ 0.4 mol/litter ≈ 10 atm (気圧)

  6. (View from water potential) 植物細胞 Plant cells 動物細胞 Animal cells 細胞膜 Plasma-membrane 細胞壁 Cell wall • Inner ψosm ≠ Outer ψosm • Presser at call wall • Inner ψw = Outer ψw • Inner ψosm = Outer ψosm • Inner ψw = Outer ψw

  7. 土壌水分が足りない場合(乾燥地、塩ストレス)土壌水分が足りない場合(乾燥地、塩ストレス) At low water potential of soil (drought/ salt stress) ψw - 0 純水 水ポテンシャル 水ポテンシャル 細胞液の水ポテンシャルを下げる(浸透圧を上げる) soil Root Soil Root soil Root soil Root Soil root ψw Strong drought/salt stress Weak drought/salt stress Wet

  8. 細胞の水ポテンシャルを下げる(浸透圧を上げる)には・・・細胞の水ポテンシャルを下げる(浸透圧を上げる)には・・・ 細胞質:糖、アミノ酸、有機物質 細胞外(土壌)水環境 核 液胞:無機イオンK+ (Na+塩生植物) Cl-     その他 (細胞質には、ほぼ一定量(150mMくらい)のK+あり) 乾燥 塩ストレス

  9. 細胞質に蓄積される 特殊な有機物質 → 適合溶質(compatible solute)とよばれる浸透圧を上げる シャペロン活性 スカベンジャー活性 ベタインとは、本来はアミノ酸のアミノ基に3つのメチル基が付いた化合物の総称。 H3N+- → (CH3)3N+- もっとも存在量の多いグリシンベタイン(=トリメチルグリシン)を、単にベタインと呼ぶことも多い。

  10. タバコ葉の例 (プロリン蓄積) グリシンベタインの合成系 塩ストレス誘導性 イネでは通常は基質不足 左: 150 mM NaCl 右: 150 mM NaCl + 5mM betaine aldelyde

  11. 表面積×面積当たりの水透過性 Surface area water permeabilityper unit area Aquaporin determins this アクアポリンの機能・構造 水ポテンシャル差 Water potential difference Water flux*=(駆動力)×(水の動きやすさ:透過性) Driving force water permeability (*per unit time)

  12. 液胞膜 Tonoplast 原形質膜(細胞膜) Plasma-membraene Before discovery of aquaporins (アクアポリン発見前)? H2O After all, the message that appeared in textbooks was that water simply diffused "somehow'' across plants membrane and proteins were not involved in these processes. Biophysicists continued to use pore models to explain membrane permeations without seeking a molecular explanation. A.R.Schaffner Planta 204:131-139 (1998)

  13. Prof. Peter Agre Novel prize (Chemistry) "for the discovery of water channels"

  14.   (タンパク) 生体膜に多量に存在する機能不明の膜タンパク CHIP28 PM28    (遺伝子) Major Intrinsic Protein (MIP)  水晶体のレンズ 大腸菌のグリセロール輸送体 (GlpF)    (機能) 細胞の水透過性 脂質二重層より 高い 「水チャネル」の存在 が示唆される (water channels suggested) Aquaporin(アクアポリン)

  15. H2O 水チャネル アクアポリン Aquaporin  植物の生育期間を通じて水の吸収と蒸散量は生重量の100倍   代謝と成長に使われるのは、約5%  水輸送は、もっとも大量の膜輸送である。 → その分子基盤がアクアポリン Aquaporins as molecular basis H2O 生体膜 membranes 10~100-hold higher water permeabiliyu with aqauporins

  16. アクアポリンの機能(水透過)の活性調節に関わるアミノ酸残基(植物の場合)アクアポリンの機能(水透過)の活性調節に関わるアミノ酸残基(植物の場合) Regulatory regions Structure in the membrane 細胞がアクアポリンを持つことは、単に水透過性を高くするということではなく、透過性を制御できる、という点で大きな意味がある。 Aquaporins ; 1) increase membrane water permeability 2) make it possible to regulate water permeability Structural features • 2 NPA motives • 6 Trans-membrane helixes (TMHs) and 5 inter-TMH loops • Phosphorylation targets

  17. Top view of AQP1 (a) Ribbon diagram(b)Space-filled one Side view of AQP1 (c) Ribbon diagram(d)Space-filled one Murata at al. (2000)Nature 407:599

  18. NHK 2007年5月9日放送

  19. ヒトアクアポリン 13個のアクアポリン(AQP)遺伝子があるヒトアクアポリン 13個のアクアポリン(AQP)遺伝子がある 皮膚のみずみずしさ → AQP3 カネボウ化粧品スキンケアブランド「suisai(スイサイ)」の高保湿クリーム「ヒアロインクリームAP」 同社の「アクアポリン(肌における“水の通り道”)研究」の成果を応用し、配合成分を強化した・・・ 原尿からの水の再吸収(腎臓)  → AQP2 EtOH → AVP↓→ Exocytosis ↓→ AQP in PM ↓ 涙 → AQP5 (壊れるとドライアイ) 唾液 → AQP5 (壊れると口腔乾燥症)

  20. 植物のアクアポリン (Plant aquaporins) Aquaporin = MIP (membrane intrinsic protein) PIP(plasm-membrane…)   (原形質膜型) TIP(tonoplast….)   (液胞膜型) NIP(Nodulin26-like…) SIP(small …) ER signaling? XIP(x …) XIPs are found in some plants (tomato, cotton, moss) but functions are not yet known シロイヌナズでは35個のMIP (35 Major Intrinsic Protein in Arabidopsis) (ヒトでは13個(human)、微生物は1から2個(bacteria)) Why many in plants?

  21. 生育ステージ:発芽、成長、生殖、結実 環境変化:乾燥←→湿潤 Regulation by; humiditiy、salt stress、light、temeperature、others 局在(localization) 細胞膜(PIP) 液胞膜(TIP) 根粒菌包膜(NIP) ER膜(SIP?) 構造(structure) >30 genes 機能(function) substrates   (H2O、CO2、B、Si・・・) Stress tolerance、growth regulation、Post-harvesting

  22. シロイヌナズナでは ポンプ トランスポーター チャネル 208種類 559種類 101種類 (すべての膜系あわせて) そもそも植物の膜輸送系遺伝子は多い 「植物の膜輸送システム」(秀潤社)より 動けない(no move) 環境適応性が高い (high adaptability) 再分化/再生能力 (regeneration)

  23. 水透過性高い:細胞質の体積を維持 High permeability: maintain cytolasm 細胞の水透過性をきめる Determining cell water permeability 細胞外(土壌)水環境 液胞 Vacuole (細胞体積の90%以上) (More than 90% volume) • Wet • Dry • Salt stress(variable) 核 細胞質(cytoplasm) Cell wall Plasma-mambrane

  24. 窒素固定にも関係? (Tyermanet al.) 空中窒素 (air N2) Leguminos root cells マメ科植物の根の細胞 Peribacteroid membrane ペリバクテロイド膜 Nutrition 栄養  N2→ NH3 H2O N-fixing bacteria 窒素固定菌 NOD26 (NIP-type aqauporin) Other susbstrate for other NIPs Si(OH)4/As(OH)4[OsNIP2;1], B(OH)3[ AtNIP5;1 ]

  25. Rice aquaporins To be elucidated 11OsPIPs(3OsPIP1s and 8OsPIP2s) in rice plants (PCP 46:568 (2005)) Individual function Redundancy Phenotype

  26. マイクロピペット アフリカツメガエル 卵母細胞(oocyte) cRNA アクアポリン H2O 水輸送活性測定 アフリカツメガエル卵母細胞による Swelling assay タンパク発現  膜ターゲティング 外液を低張液に交換 卵に水を吸わせる・・・          吸水が早くなるか?

  27. なぜアフリカツメガエルの卵を使うの? • アフリカツメガエルの卵に植物の遺伝子など外からRNAを注入すると、卵でRNAからタンパク質が合成される。内在性のタンパク質はほとんど発現していない。 • 卵は本来水の輸送活性が低いので、RNA注入で多くの水を吸収した場合、合成されたタンパク質に水を運ぶ働きがあることになる。 • アフリカツメガエルは生命力が強く、飼育しやすい。また広く研究に使われており、入手が容易。

  28. ←20秒毎の写真を高速(実際の約200倍の早さ)で再生したもの←20秒毎の写真を高速(実際の約200倍の早さ)で再生したもの 多量の水が入り込んだため、卵が破裂し内容物が溶出している オオムギアクアポリン遺伝子の一つ HvPIP2;1-injected Negative control (water-injected) 破裂→ 水輸送活性あり! アフリカツメガエル卵母細胞を使った異種遺伝子発現/機能解析系

  29. Water permeability (in oocyte system) (Barley PIPs) (Rice PIPs) HvPIP2;1 ~ 2;5 Relative volume ┏ Immunofluoresence ┓ (透過性) 抗HvPIP2;4抗体 抗HvPIP1s抗体 HvPIP1;1 ~ 1;5 and neg. cont. HvPIP2;4 単独発現 HvPIP1;2 単独発現 OsPIP2isoforms HvPIP2;4-injection HvPIP1;2-injection Time (sec) (Horie et al. et al. PCP 52:663 (2011)) OsPIP1isoforms Low water transport activity of PIP1s in oocytes (apprentice) PIP1は単独で膜へ移行しない No membrane localization PIP1s alone (Matsumoto et al. PCP 50:216 (2009))

  30. 膜に行っていても活性のない場合も (透過性) HvNIPs and OsNIPs (Katsuhara in preparation) EGFP-OsNIP2;2 injection Bright field GFP fluorescence

  31. 構造・機能改変 Molecular engendering Aminoacidsequencealignmentofthe region containing E-loop and the 6th TMH of barleyPIPs. いずれも 水輸送活性あり 254M in HvPIP2;4  254I in HvPIP2;3

  32. 254M can transport water 254Y cannot transport water HvPIP2;4M254I enhanced water transport activity Water transport activity can be artificially modulated