Polymerasa Chain Reaction (PCR) và các bước của phản ứng PCR

1. Polymerasa Chain Reaction (PCR) và nh?ng b??c c?a ph?n ?ng PCR Polymerase Chain Reaction (PCR) là gì? nh?ng b??c c?a ph?n ?ng PCR. Ph?n ?ng PCR hay còn g?i là “ph?n ?ng khu?ch ??i gene”, là khoa h?c ?a d?ng trong sinh v?t h?c phân t? nh?m khu?ch ??i (t?o ra ph? bi?n b?n sao) t? 1 ?o?n DNA mà ko nên dùng các sinh v?t s?ng. G Phân t? DNA g?m 2 m?ch ??n, ???c c?u thành b?i các nucleotide A, T, G, C và n?i b?ng các link c?ng hóa tr?; 2 m?ch ??n ???c ph? tr? theo c?u trúc ??i ??ng th?i. G PCR ?? nh?n di?n và nh?n th?y 1 ?o?n gene c? th? trong b? gen (ng??i, ??ng v?t, th?c v?t, vi khu?n…) Ph?n ?ng PCR g?m có 3 b??c ch? ??o: G Bi?n tính (Denature DNA): DNA m?ch ?ôi tách thành m?ch ??n ( 94 – 96oC). G B?t c?p (Anneal primer): Nhi?t ?? h? xu?ng (50 – 65oC), nh?ng primer bám vào phân t? DNA, th?c ch?t c?a primer là các ?o?n DNA m?ch ??n có ?? dài t? 15 – 30 nucleotide. G Kéo dài (Extend primer): Nhi?t ?? t?i ?u ?? enzyme t?ng h?p DNA m?ch m?i ho?t ??ng (70 – 72oC) – công ?o?n t?i ?u ?? t?ng h?p DNA m?ch m?i ho?t ??ng. Thành ph?n ph?n ?ng PCR: 1. H2O (nuclear mi?n phí water): Môi tr??ng ho?t ??ng cho các thành ph?n còn l?i. 2. Dung d?ch ??m (Buffer): ?n ??nh môi tr??ng DNA polymerase, DNA và các nu. G Ch?a nh?ng lo?i mu?i: + 500mM KCl. + 100mM Tris-HCl, pH 8.3 + Triton X-100/ Tween. G Môi tr??ng có l?c ion giúp ?n ??nh s? ho?t ??ng c?a enzyme, c?u trúc DNA và các nucleotide. 1. M?ch khuôn DNA (DNA template): G Ch?a vùng gene ph?i nhân b?n. G b?t c? lo?i DNA nào (có Ngu?n g?c xu?t x? t? ??ng v?t, th?c v?t, vi khu?n…). G Có th? ???c tinh s?ch (th??ng là trong tr??ng h?c) ho?c không. ??c bi?t v?i vi khu?n: ?un sôi d?ch vi khu?n ?? t? bào v? ra, DNA ???c gi?i phóng sau ?y th?c hi?n PCR. G L?u ý: D?ch DNA ?em PCR ko c?n ch?a ch?t ng?n c?n ho?t ??ng c?a enzyme.

3. 1. Primer (reverse, forward): G ??c hi?u cho 2 ??u ?o?n gene nên khu?ch ??i. G Nhi?t ?? nóng ch?y: ph? thu?c vào ?? dài m?i, thành ph?n G – C… G Chi?u dài: 15 – 30nt. 1. Nucleotide (nNTP: dATP, dTTP, dGTP, dCTP): G ???c l?p ??t trong công ?o?n kéo dài. G Tr? ? 10mM, pH 7.0 G N?ng ??: 20 – 200uM. 1. Ion Mg2+ (Magnesium): G Là Co-factor quan tr?ng c?a DNA polymerase -> nên có ion này, enzyme m?i ho?t ??ng ???c. G L?u ý: + tr??ng h?p quá ít Mg2+: Enzyme không ho?t ??ng; gi? d? quá ?a d?ng Mg2+: Ph?n ?ng kém ??c hi?u. G N?ng ??: 0,5 -> 3,5mM. 1. Enzyme DNA polymerase: G Enzyme ch?u nhi?t – T?ng h?p m?ch DNA m?i xây d?ng m?ch khuôn & primer. Taq ho?c t??ng t? Taq. G N?ng ??: 1unit/1P?. G khi nhi?t ?? t?ng lên ??n 95oC ?? tách m?ch thì enzyme này v?n gi? ???c ho?t tính. th??ng nh?t, b?n tính enzyme là protein, protein s? b? m?t c?u trúc lúc ? nhi?t ?? quá cao; không nh?ng th? ??i v?i Taq và m?t s? enzyme ch?u nhi?t khác thì c?u trúc v?n ??m b?o. G Nhi?t ?? ho?t ??ng t?i ?u (Khi Taq l?p ghép nh?ng nucleotide t? do ? môi tr??ng vào m?ch m?i): 72o G Chi?u t?ng h?p: 5’->3’. ??c trên website: https://visitech.vn/polymerasa-chain-reaction-pcr-va-cac-thanh-phan-cua-phan-ung-pcr/