Modèles d’étude

1. Impact des radiations UV sur les communautés cyanobactériennes Modèles d’étude Synechococcus sp. WH8102 Prochlorococcus MED4 • Abondants dans les eaux mésotrophes et oligotrophes • Distribution verticale : peu abondant < 100 m • Ecotype pélagique • Génome disponible • Manipulable génétiquement • Abondants dans les eaux oligotrophes • Concentration : souvent > a 105 cell.ml-1 • Distribution verticale : de 1 à 100 m • Ecotype de surface • Génome disponible Approches • Etudier l’effet des UV sur la photosynthèse, le cycle cellulaire et la réparation des dommages • à l’ADN dans différentes conditions de culture. • Identifier de nouveaux gènes impliqués dans la résistance aux UV (Gel 2D, Microarrays). • Mise au point de marqueurs du stress UV applicables en milieu naturel.

2. Participants pour la Station Biologique de Roscoff • Samuel Chaffron (MST, Mise en place du Turbidostat) • Alexis Dufresne (Thèse, Bioinformatique) • Chistophe Six (Thèse, Protéomique) • Ludovic Chopin (DEA, Biologie Moléculaire) • Julia Holtzendorff (Post doc, Biologie Moléculaire) • Dominique Marie (IE, Cytométrie en Flux) • Laurence Garczarek (CR1, Biologie Moléculaire) • Jean-Francois Lennon (CR1, Physicien) • Fredéric Partensky (DR2, Coordinateur)

3. Expériences Prévues dans le Cadre d’UVECO • Cyclostat en lumière jour-nuit modulée (PAR + UVA + UVB) • Microarrays : Complet et/ou miniarray (environ 150 gènes) • Gènes photosynthétiques : Centres Réactionnels, Phycobilisomes, Synthèse des pigments (chlorophylle, caroténoides), Gènes de stress lumineux (HLIP) • Réparation des dommages à l’ADN • Antioxydants • Protéines Heat shock • Systèmes à deux composants • Transcription/Machinerie régulatoire • Fixation du carbone • Intégrité membranaire • Synthèse protéique • Expérience de shift ou acclimatation de Synechococcus à différentes lumières (UVA, B) • Genétique sur Synechococcus(Mutants ponctuels, librairies de mutants) • Biosenseur en temps réel (utilisant le gène recA ?)

4. 1500 μE Niveau d’éclairement x x x 0 18 18 6 18 6 18 6 18 6 Temps (heures) UVA UVB PAR Photodiodes Construction du Cyclostat MILIEU DE CULTURE Pompes péristaltiques UVA, UVB PRELEVEMENTS PAR POUBELLE CULTURE

5. x x x Construction du Cyclostat MILIEU DE CULTURE Bain circulant Thermostaté Pompes péristaltiques Prélèvement automatique des échantillons POUBELLE CULTURE

6. Paramètres étudiés à partir du Cyclostat • Cytométrie en Flux : • Croissance et cycle cellulaire • Formation intracellulaire de composés d’oxygène réactifs ? • Gels 2D • Identification de protéines différentiellement exprimées • PCR Quantitative • Expression de différents gènes impliqués dans la photosynthèse, la photoprotection, le cycle cellulaire et la formation de dommage à l’ADN • Microarrays (Mise en évidence de nouveaux gènes impliqués dans la résistance aux UV) • Péroxydation des lipides membranaires (dosage a l’acide thiobarbiturique) • Dosage des groupements -SH(C. Six) • Composition pigmentaire (HPLC, spectrofluorimétrie,C. Six, F. Lantoine) • Variation des paramètres photosynthétiques (P. Conan) ? • Dommages à l’ADN (dosage des CDPs,F. Joux) • Modifications biochimiques (sucres, acides aminés,R. Sempéré)

7. 18:00 6:00 18:00 6:00 Volumes prélevés et fréquence des prélèvements sur le cyclostat Méthodes d'analyses Volumes Prélevés Cytométrie en Flux(D. Marie) Croissance, cycle cellulaire, 2 x 1 ml Espèces réactives de l'O2 toutes les 30 min Analyse pigmentaire(C. Six, F. Lantoine) HPLC 3 x 50 ml Spectrofluorimétrie 1.5 ml Mycosporines ? Paramètres photosynthétiques(P. Conan)? ARN(L. Garczarek) Microarrays + PCR Q 700 ml Gels 2D (C. Six)2 ou 3 points/jour Exp indép Groupements –SH(C. Six) ? Dimères de thymidine/ Protéines carbonylées(F. Joux) ? Dommages lipidiques(C. Six ou F. Joux) ? Malondialdehyde Modifications Biochimiques(R. Sempéré) ? Sucres, acides aminés 1500 Growth irradiance (µE.m-2.s-1) 750 0 Time Points de prélèvement 6h, 9h, 12h, 15h, 18h, 22h, 2h Volume Maximum prélevé = 900 ml/ point

8. Calendrier récapitulatif 2003 2004 2005 2006

12. Macroarray Gene Selection • Model : Synechococcus WH8102 • 2 Arrays : Photosynthesis/Photoprotection/UV stress • Small ORF in Synechococcus (< 100 Amino Acid) • Structure : Hybridization/Scanning : • Genopole Grand Ouest (Plateform of Rennes) • Laboratory of Frédérique Hubler • Bioinformatic/Statistic Treatment : • Genopole Grand Ouest (plateform of Nantes) • Conditions : First array limited to 100-150 genes • Oligonucleotide/PCR product ? • Control:Stress: Cy3/Cy5

13. Photosynthetic genes Gene Name • 1 photosystem II D1 protein form II psbA2 • 2 photosystem II D2 protein psbD1 • photosystem I P700 chlorophyll a apoprotein subunit psaA • Ia (PsaA) • 4 photosystem II chlorophyll-binding protein CP43 psbC • 5 photosystem II chlorophyll-binding protein CP47 psbB Phycobilisomes Phycoerythrin Allophycocyanin Phycocyanin Stroma CP47 CP47 D2 D2 Thylacoïdale Membrane D1 PsaA PsaB CP43 D1 CP43 D1 Lumen PsaI/L PsaF/J PsaM CR II CR I Photosystem I Photosystem II

14. Pigment synthesis Gene name 6 chlorophyll synthase 33 kD subunit chlG 7 possible light-dependent protochlorophyllide oxido-reductase pcr, por 8 light-independent protochlorophyllide reductase subunit B chlB 9 lycopene beta cyclase crtL 10 beta-carotene hydroxylase crtR 11 carotenoid binding protein or0312 12 possible beta-carotene ketolase or0313 13 conserved hypothetical protein or0315 Chlorophyll synthesis Carotenoids synthesis DV-Protochlorophyllide a2 lycopene lycopene β cyclase Protochlorophyllide oxydoreductase (or0543, or0791, or1537) Protochlorophyllide reductase (or0544, or0545, or0545) γ-carotene lycopene β cyclase β-carotene Chlorophyllide a2 β-carotene hydroxylase β-cryptoxanthin Chlorophyll synthase β-carotene hydroxylase Chlorophyll a2 zeaxanthin