1. 实验三 大肠埃希菌的生化反应、 沙门志贺菌的生化反应

2. 一、 目的和要求： 1.掌握大肠埃希菌的生化反应和鉴定依据 2.掌握沙门菌属、志贺菌属细菌的生化反应及鉴定意义

3. 二、肠杆菌科活泼的生化反应 发酵葡萄糖产酸，乳糖发酵试验 O/F试验为发酵型 ， 氧化酶阴性，氧化酶试验 触酶阳性，触酶试验 还原硝酸盐为亚硝酸盐。硝酸盐还原试验

4. 三、其他生化反应 • 1.MIU（动力、吲哚、脲酶）复合试验 • 方法：于MIU培养基的中心处向下垂直穿刺接种细菌，直至试管底部上方5mm左右（不能穿刺管底），接种后的接种针沿原穿刺线退出，37℃培养18-24h，观察动力和脲酶反应后，再滴加吲哚试剂。吲哚试验 • 注：滴加吲哚试剂时需沿管壁徐徐滴入，稍待片刻即观察液面上是否出现红色化合物，随时间的推移，红色化合物会扩散以至不清晰。

5. 实验结果 M I U 动力 吲哚 脲酶 大肠埃希菌 + + - 福氏志贺菌 - +/- - 伤寒沙门菌 + - - 甲副 + - - 乙副 + - -

6. 2.KIA （克氏双糖铁高层斜面）复合试验 • 方法：将待检菌于KIA培养基底层穿刺，然后上提接种针，从斜面底部向上划一条直线，然后由斜面底部向上做曲线划线。标记，37℃培养24h。 • 原理：Glu、Lac之比为1∶10。 • ①细菌如发酵Glu、Lac产酸产气，则斜面、底层均呈黄色，且有气泡； • ②如只发酵Glu不发酵Lac，因Glu含量少，斜面生成的少量酸可因接触空气而氧化挥发，从而使斜面部分保持原来的红色，底层相对缺氧，发酵Glu所生成的酸类不被氧化挥发仍呈黄色。 • ③细菌分解Pr产生H2S ，则与硫化亚铁作用生成黑色的硫化铁，使培养基变黑。硫化氢试验

7. 结果判断： • ①发酵Glu、Lac产酸产气，上层、底层均呈黄色具有气泡 记为：A/A 产气 • ②只发酵Glu不发酵Lac，底层变黄，上层仍为红色 记为：K/A • ③培养基变黑，则产生H2S，产生黑色的硫化铁沉淀。

8. 实验结果 KIA 斜面 底面 产气 H2S 大肠埃希菌 A A + - 福氏志贺菌 K A - - 伤寒沙门菌 K A - + 甲副 K A + - 乙副 K A + ++

9. 大肠埃希菌KIA（AA＋－）MIU（＋＋－）

10. 伤寒沙门菌KIA（K A－＋）MIU（＋－－）

11. 志贺菌KIA（K A－－）MIU（－－－）

12. 3.IMViC试验 • 吲哚试验 • 甲基红试验 • V-P试验 • 枸橼酸盐试验

13. （1）吲哚试验 • 原理：某些细菌具有色氨酸酶，能分解蛋白胨水中的色氨酸产生吲哚，当加入吲哚试剂-柯氏试剂（对二氨基苯甲醛）后则形成红色的玫瑰吲哚 • 培养基：蛋白胨水 • 方法：待测菌接种于培养基，37 ℃培养24-48h，沿试管壁缓慢加入吲哚试剂 • 结果：于两者接触面出现红色为阳性，无色为阴性 • 意义：肠杆菌科细菌的鉴定；大肠杆菌、产酸克雷伯为阳性

14. （2）甲基红试验 • 原理：细菌分解葡萄糖产生丙酮酸，后者进一步生成甲酸、乙酸、乳酸等，使培养基的PH降至4.5以下，加入甲基红试剂后显红色即阳性。若产酸量少，或进一步转化为其他物质，则培养基的PH仍在6.2以上，加入甲基红试剂后显黄色，为阴性 • 培养基：葡萄糖蛋白胨水 • 方法：待测菌接种于培养基，2-4天后，加入甲基红试剂，观察结果 • 结果：呈现红色为阳性，橘红色为弱阳性，黄色为阴性 • 意义：大肠、沙门、志贺、变形、枸橼酸杆菌、等为阳性；肠杆菌属、哈夫尼亚菌属为阴性

15. （3）V-P试验 • 原理：细菌分解葡萄糖产生丙酮酸，后者脱羧产生乙酰甲基甲醇，乙酰甲基甲醇在碱性环境中被氧化为二乙酰，进而与培养基中蛋白胨内精氨酸中的胍基作用，生成红色化合物，即为V-P试验阳性。α奈酚可加速此反应 • 培养基：葡萄糖蛋白胨水 • 方法：待测菌接种于培养基，35 ℃48h，加入甲液（6%α奈酚酒精溶液）和乙液（40 %KOH溶液） • 结果：20min内出现红色为阳性，如无红色，且于35 ℃4h 后仍如故即为阴性 • 意义：本试验常与甲基红一起试验，前者阳性则后者多阴性

16. （4）枸橼酸盐利用试验 原理：某些细菌能以枸橼酸盐为唯一碳源，可在枸橼酸盐培养基上生长，分解枸橼酸盐，使培养基变碱 培养基：枸橼酸盐培养基 方法：待测菌接种于培养基37℃培养18-24h，观察结果 结果：培养基中的溴麝香草酚兰指示剂由淡绿色变为深蓝色为阳性，不变色为阴性 意义：克雷伯菌属、沙门菌属常为阳性

17. 大肠埃希菌IMViC试验（＋＋－－） 右侧为对照（－－＋＋）

18. 沙门菌IMViC试验（－＋－－）

19. 志贺菌IMViC试验（－＋－－）

20. 大肠埃希菌、志贺菌、沙门菌基本生化反应小结大肠埃希菌、志贺菌、沙门菌基本生化反应小结 M I U KIA 动力 吲哚 脲酶 斜面 底面 产气 H2S 氧化酶 触酶 枸橼酸盐 大肠埃希菌 + + - A A + - - + - 福氏志贺菌 - +/- - K A - - - + - 伤寒沙门菌 + - - K A - + - + d 甲副 + - - K A + - - + - 乙副 + - - K A + ++ - + d

21. 四、本次实验内容 • 1.氧化酶试验 • 2.触酶试验 • 3.硝酸盐还原试验 • 4.MIU复合试验 • 5.KIA试验

22. 乳糖发酵试验 初步鉴别肠道致病菌和肠道非致病菌 肠道致病菌 不发酵乳糖 肠道非致病菌 发酵乳糖 返回

23. 氧化酶试验 原理：细胞色素氧化酶是细胞色素呼吸酶系统的最终呼吸酶，具有氧化酶的细菌，首先使细胞色素C氧化，再由氧化型细胞色素C使对苯二胺氧化，生成有色的醌类化合物 试剂：1%盐酸四甲基对苯二胺或1%盐酸二甲基对苯二胺 方法：用滤纸条沾取被检菌落，用滴管吸取氧化酶试剂，滴加于滤纸条菌落上。 结果：阳性者立即出现红色。氧化酶试验 阳性：红色 阴性：无色 应用：肠杆菌科细菌与假单胞菌的区别。 前者阴性，后者多阳性 返回

24. 触酶试验 • 原理：具有过氧化氢酶的细菌，能催化过氧化氢生成水和氧，出现气泡。 • 试剂：3%过氧化氢溶液 • 方法：取菌置于洁净的试管或玻片上，然后滴加3%过氧化氢数滴，观察结果 • 结果：出现大量气泡的为阳性，不产生气泡的为阴性 • 意义：常用于革兰阳性球菌的鉴别，葡萄球菌为阳性，链球菌为阴性。 肠杆菌科细菌触酶阳性 返回

25. 硝酸盐还原试验 原理：某些细菌能还原培养基中的硝酸盐成生成亚硝酸盐、氨和氮等，亚硝酸盐与醋酸作用生成亚硝酸，亚硝酸与对氨基苯磺酸作用生成重氮苯磺酸，后者与-萘酚结合为红色的N--萘胺偶氮苯磺酸。 培养基：硝酸盐培养基 试剂：甲液（对氨基苯磺酸），乙液（α奈胺） 方法：待测菌接种于培养基，37 ℃培养18-24h，将甲乙液分别加入培养基，立即观察结果 结果：出现红色为阳性 硝酸盐还原试验 阳性：红色 阴性：淡黄色 注意：若加入试剂后无反应，可能是①硝酸盐没有被还原，试验阴性②硝酸盐被还原为氨和氮等其他产物而致假阴性，此时要加入少许锌粉，若出现红色则为阴性，不产生红色则为假阴性，实际为阳性 意义：肠杆菌科为阳性；铜绿、嗜麦芽能产生氮气。 返回

26. 吲哚（靛基质）试验 原理：某些细菌具有色氨酸酶，能分解蛋白胨水中的色氨酸产生吲哚，当加入吲哚试剂-柯氏试剂（对二氨基苯甲醛）后则形成红色的玫瑰吲哚 培养基：蛋白胨水 方法：待测菌接种于培养基，37 ℃培养24-48h，沿试管壁缓慢加入吲哚试剂 结果：于两者接触面出现红色为阳性，无色为阴性 意义：肠杆菌科细菌的鉴定；大肠杆菌、产酸克雷伯为阳性

27. 尿素分解试验 • 原理：某些细菌具有尿素分解酶，能分解尿素产生大量的氨，使培养基呈碱性 • 培养基：尿素培养基 • 方法：待测菌接种于培养基，37 ℃培养18-24h，观察结果 • 结果：培养基呈碱性，使酚红指示剂变红为阳性，不变为阴性 • 意义：变形杆菌、摩根氏、雷氏普罗维登氏、克雷伯氏为阳性 返回

28. 硫化氢试验 原理：某些细菌能分解培养基中的含硫氨基酸，产生硫化氢，后者遇亚铁离子或铅则形成黑褐色的沉淀。 培养基：醋酸铅培养基 方法：待测菌接种于醋酸铅培养基，37℃培养24-48h观察结果 结果：培养基变黑为阳性，不变为阴性 意义：沙门菌属、爱德华菌属、亚利桑那菌属、枸橼酸杆菌属、变形杆菌属、腐败假单胞菌为阳性 返回

29. 氧化酶试验阳性：紫红色阴性：无色 返回

30. 硝酸盐还原试验阳性：红色 阴性：淡黄色 返回