Applications de la cytométrie en flux

1. Présentation du Dr Hanna SOVALATde l’Institut de Recherche en Hématologie et Transplantation – MULHOUSEstage PAF : Cytométrie en flux du 26/11/07

2. Applications de la cytométrie en flux A: Application en routine: • Immunophénotypage: Expression quantitative d’antigènes de surface ou intracellulaire (immunologie, hématologie) • Quantification de l’ADN • Étude du cycle cellulaire • Viabilité cellulaire • Apoptose B: Application en recherche: • Flux calcique • pH intracellulaire • Potentiel de la membrane cytoplasmique et mitochondriale • Mesure oxydatif • Etc… cancérologie,pharmacologie et cytogénétique Analyse des fonctions cellulaires

3. Applications de la cytométrie en flux A.1/ Immunophénotypage (Analyse des antigènes): La réaction d’immunofluorescence associe la spécificité des anticorps monoclonaux et les propriétés des fluorochromes. Elle implique un anticorps fluorescent qui se lie spécifiquement à une molécule de surface ou intracellulaire.

4. Applications de la cytométrie en flux A.1/ Immunophénotypage: Technique de marquage

5. Applications de la cytométrie en flux A.1/ Phénotypage: Méthodes d’amplifications

6. Applications de la cytométrie en flux A.1/ Immunophénotypage: Les fluorochromes utilisés Un fluorochrome utilisable et analysable en CMF doit avoir les proprietés suivantes: • Absorber la lumière à des longueurs d’ondes existantes sur les lasers équipant le cytomètre. • Avoir un différence de longueur d’onde suffisante entre l’absorption et l’émission maximale. • Avoir un bon rendement quantique défini par le taux d’énergie entre la lumière émise et la lumière absorbée • Pouvoir être lié aux anticorps monoclonaux en gardant ses propriétés spectroscopiques après conjugaison.

7. Applications de la cytométrie en flux Introduction de contrôles négatifs afin d’éliminer de l’analyse les éventuelles fixations aspécifiques des différents réactifs employés. • Anticorps « non réactifs » de même isotype que l’anticorps test. • En fluorescence indirect, l’anticorps secondaire couplé au fluorochrome doit être le même que dans l’échantillon test.

8. Applications de la cytométrie en flux A.1/ Immunophénotypage: Double immunofluorescence

9. Applications de la cytométrie en flux A.1/ Immunophénotypage: Etude du phénotypage MDR en clinique

10. Applications de la cytométrie en flux A.1/ Immunophénotypage: Dosage des cytokines pour étude du phénotype TH1/TH2

11. Applications de la cytométrie en flux A.1/ Immunophénotypage: Dosage des cytokines

12. Applications de la cytométrie en flux A.1/ Immunophénotypage: Dosage des cytokines

13. Applications de la cytométrie en flux A.1/ Immunophénotypage: Etude du phénotypage MDR en clinique

14. Applications de la cytométrie en flux A.2/ Quantification de l’ADN: • Les cellules eucaryotes sont caractérisées par un compartiment nucléaire (noyau) renfermant la totalité de l’ADN génomique. • Le contenu en ADN est caractéristique d’une espèce cellulaire, et sa variation peut indiquer un état d’activation normal (réplication des chromosomes en cours de division cellulaire), ou anomalie de structure de l’ADN nucléaire (cas de certains cancers).

15. Applications de la cytométrie en flux A.2/ Quantification de l’ADN: Fluorochromes utilisés L’utilisation d’un colorant spécifique de l’ADN permet de mesurer quantitativement son contenu pour chaque cellule. 2 groupes de fluorochromes: • Fluorochromes spécifiques des paires de bases de l’ADN: A-T ou G-C • Hoechst 3342 • DAPI • Fluorochromes intercalant • Iodure de propidium • Bromure d’éthidium • Acridine orange

16. Applications de la cytométrie en flux A.2/ Quantification de l’ADN:

17. Applications de la cytométrie en flux A.3/ Cycle cellulaire: Observation des cellules au microscope

18. Applications de la cytométrie en flux A.3/ Cycle cellulaire: On peut diviser l’ensemble des évènements biochimiques qui président à la prolifération cellulaire en 4 étapes du cycle cellulaire: • PhaseG1: Activation de la cellule, préparation à la réplication de l’ADN • Phase S (Synthèse): Réplication du matériel génétique • Phase G2: La cellule duplique son matériel génétique • Phase M (Mitose): Succession d’évènements (prophase, prémétaphase, métaphase, anaphase, télophase et cytodiérèse) pour donner la naissance de 2 cellules filles

19. Applications de la cytométrie en flux A.3/ Cycle cellulaire

20. Applications de la cytométrie en flux A.3/ Cycle cellulaire

21. Applications de la cytométrie en flux A.4/ Viabilité cellulaire:

22. Applications de la cytométrie en flux A.5/ Apoptose

23. Applications de la cytométrie en flux A.5/ Apoptose

24. Applications de la cytométrie en flux A.5/ Apoptose

25. Applications de la cytométrie en flux A.5/ Apoptose

26. Applications de la cytométrie en flux A.5/ Apoptose

27. Applications de la cytométrie en flux A.5/ Apoptose

28. Applications de la cytométrie en flux A.5/ Apoptose

29. Applications de la cytométrie en flux B.1/ Applications en recherche: Flux calciques • L’étude des flux calciques est d’une très grande importance en biologie cellulaire. • Le calcium joue un rôle de médiateur de transduction des signaux dans la membrane plasmique.

30. Applications de la cytometrie en flux B.1/ Flux calciques: Les fluorochromes développés pour analyser les flux calciques sont facilement incorporés dans les cellules.

31. Applications de la cytométrie en flux Des applications très nombreuses ont été développées: • Possibilité de détecter des hétérogénéités dans l’activation • Des sous populations lymphocyaires • De glioblastome par PDGF • De plaquette par l’alpha-trombine • Étude de l’induction de la prolifération au cours du vieillissement • Analyse des effets pharmacologiques des substances au cour de la différenciation dans les cellules tumorales

32. Applications de la cytométrie B.1/ Applications en recherche: Flux calciques

33. Applications de la cytométrie B.2/ Application en recherche: Le pH intracellulaire Le pH de l’organisme est contrôlé de manière stricte et varie peu. Il en va de même au niveau cellulaire et intracellulaire. Le pH intracellulaire joue un rôle important dans plusieurs processus métaboliques et par conséquent dans l’homéostasie cellulaire. Le système d’échange, électriquement neutre, Na+/H+ est principalement responsable de la régularisation du pH intracellulaire permettant à une cellule normale au repos, d’avoir un pH d’environ 7,2. Principales causes de l’augmentation du pH intracellulaire: • Sous l’effet de stimuli pharmacologiques comme les esters de phorbols • L’activation cellulaire avec des mitogènes • Au cours de la phase S du cycle cellulaire (pH compris entre 7,4 et 7,5).

34. Applications de la cytométrie en flux B.2/ Applications en recherche: Le pH intracellulaire Le mouvement d’ions intracellulaires dus à des modifications de flux protoniques sont actuellement étudiés par cytométrie en flux. Les sondes fluorescentes des flux protoniques excitées à 488nm (Laser à Argon): • BCECF: Sa fluorescence augmente avec le pH intracellulaire (env 25 canaux) • SNARF: Présente un déplacement de spectre en fonction du pH. Émission maximale à 570nm pour un pH de 6 et émission maximale à 640nM pour un pH de 9

35. Applications de la cytométrie en flux B.2/ Applications en recherche:pH intracellulaire

36. Applications de la cytométrie en flux B.3/ Applications de la recherche: Potentiel de la membrane cytoplasmique et mitochondriale Les bases du potentiel transmembranaire: • Les cellules procaryotes et eucaryotes, même au repos maintiennent des gradients ioniques entre le milieux intra et extracellulaire pour les ions calcium, potassium, sodium et chlore. • Dans les « potentiels transmembranaires » on distingue le potentiel plasmique, potentiel mitochondriale et plasmique. • Le potentiel membranaire ( l’intérieur est chargé négativement) varie de 10 à 90mV pour une cellule au repos. • Le potentiel mitochondriale varie de 110 à 210mV.

37. Applications de la cytométrie en flux B.3/ Applications de la recherche: Potentiel de la membrane cytoplasmique et mitochondriale • Le potentiel membranaire peut être calculé à condition que l’on puisse déterminer les concentrations externes (dans le milieu) et internes (dans la cellule) de la sonde utilisé. • En cytométrie en flux les mesures sont portées sur des comparaisons d’intensité de fluorescence entre échantillons. • On peut déterminer le potentiel maximal (hyperpolarisation) ou minimal (dépolarisation).

38. Fluorochrome λ max Exc. Charge à pH 7 Spécificité Δψ mito Spécificité Δψ plasm Di-Ba-C4(3) Di-Ba-C4(5) 495 517 - - - - +++ +++ DiOC2(3) DiOC4(3) DiOC5(3) DiOC6(3) DiOC7(3) DiS-C3-(5) 490 490 490 490 490 633 + + + + + + +/- + + ++ + + ++ ++ + +/- +/- ++ Rhodamine 123 494 + +++ +++ Pyronine Y 454 + + - Applications de la cytométrie en flux • B.3/ Applications de la recherche: Potentiel de la membrane cytoplasmique et mitochondriale

39. Applications de la cytométrie en flux • B.3/ Applications de la recherche: Potentiel de la membrane cytoplasmique et mitochondriale

40. Applications de la cytométrie en flux B.4/ Applications de la recherche: Mesure du stress oxydatif • Les activités enzymatiques constituent une part importante des réactions enzymatiques du métabolisme intermédiaire. • Des altérations dans le déroulement des réactions enzymatiques produisent des dysfonctionnements majeurs dans la cellule. Ceci explique pourquoi ces activités sont régulierements étudiées au cours du processus de différenciation cellulaire.

41. Applications de la cytométrie en flux • Les réactions oxydatives: Les fluorochromes utilisés permettent de suivre des réactions de production d’anion superoxyde par NADPH-oxydase fixée dans la membrane. • Les fluorochromes: Les substrats utilisés sont dit « fibrinogènes » car ils acquièrent leur propriétés de fluorescence après un ou plusieurs clivages enzymatiques, dépendant de leur activité oxydatives • DCFH-DA • DHR 123 • Hydroéthidine B.4/ Applications de la recherche: Mesure du stress oxidatif

42. Applications de la cytométrie en flux B.4/ Applications de la recherche: Mesure du stress oxydatif

43. Applications de la cytométrie en