Detecção por imunocitoquímica de VEGF no pénis do rato

1. Detecção por imunocitoquímica de VEGF no pénis do rato Cristina Resende Diana Cruz T6

2. Objectivo • Mapear a localização preferencial do VEGF (vascular endothelial growth factor) no pénis do rato Insere-se num projecto de investigação do que tem como objectivo mapear e comparar a localização do factor de crescimento no pénis em diversos grupos de risco.

3. Componentes principais: Uretra 3 corpos cilíndricos de tecido eréctil 2 Corpos cavernosos - na parte dorsal Corpo esponjoso – anteriormente; a revestir a uretra Histologia do pénis Fig. 1: Corte transversal de pénis humano

4. Os corpos cavernosos são envolvidos por uma camada resistente de tecido conjuntivo denso - a túnica albugínea. O tecido eréctil que compõe os corpos cavernosos e o corpo esponjoso tem uma grande quantidade de espaços cavernosos separados por trabéculas de fibras de tecido conjuntivo e células musculares lisas. Fig. 2: Corte transversal de pénis humano (maior ampliação)

5. Fisiologia da erecção (I) • Óxido nítrico – Essencial ao fenómeno de erecção • Molécula sinalizadora parácrina • Sintetizado a partir do aminoácido arginina • Difunde-se directamente através da membrana plasmática das células alvo • Molécula extremamente instável, com um tempo de semi-vida curto (alguns segundos)

6. Fisiologia da erecção (II) Fig. 3 Papel do óxido nítrico no relaxamento do músculo liso

7. Epidemiologia da disfunção eréctil • estudos epidemiológicos demonstram uma associação entre o envelhecimento e a disfunção eréctil declínio da actividade sexual e da função eréctil com o envelhecimento Estima-se que a percentagem de homens sem disfunção eréctil diminui de 60 para 33% entre os 40 e 70 anos de idade.

8. doença aterosclerótica das artérias penianas principal causa da disfunção eréctil relacionada com a idade Disfunção eréctil não é necessariamente uma consequência inevitável da idade associada a patologias concomitantes Factores de risco vascularcomo hipertensão, hipercolesterolemia, tabaco e diabetes associados a maior probabilidade de disfunção eréctil

9. Outros factores de risco: • declínio da produção hormonal, nomeadamente de androgénios • Factores psicológicos • Efeitos laterais de fármacos utilizados na terapêutica de patologias concomitantes

10. Importância do estudo • Última década  grande preocupação nesta área • Crescimento populacional • Aumento da esperança média de vida Acréscimo importante na prevalência de diversas patologias, incluindo a disfunção eréctil • Compreensão mais aprofundada dos mecanismos fisiopatológicos da disfunção eréctil com vista à orientação de novas linhas terapêuticas

11. Alterações estruturais e ultrastruturais nos componentes fibroelásticos das: trabéculas penianas, músculo liso cavernoso endotélio inadequada expansão sinusoidal rigidez do pénis erecto

12. Farmacologia para melhorar a erecção peniana Medicamentos de acção periférica de actuação predominantemente vasoactiva como os inibidores da fosfodiesterase tipo 5 Viagra

13. Angiogénese terapêutica 1 dos factores responsáveis pela disfunção eréctil • desordens do fluxo arterial • relaxamento do músculo liso cavernoso • disfunção venooclusiva Disfunção endotelial Traduz-se em: Alvo farmacológico válido na prevenção da disfunção eréctil

14. Neovascularização cavernosa é controlada por factores de crescimento angiogénicos que promovem a proliferaçãoemigração de células endoteliaisemusculares lisas VEGF um dos factores mais importantes, que ainda estimula a produção de óxido nítrico

15. VEGF • Família de proteínas que actuam sobre células endoteliais, estimulando a angiogénese • Parente distante do factor de crescimento derivado de plaquetas (PDGF) • Compreende 5 membros: VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C,VEGF-D e factor de crescimento da placenta (codificados por genes distintos) • Produzido em vários tipos de células vasculares (endoteliais, musculares lisas e fibroblastos)

16. A administração intracavernosa de VEGF em modelo animal estimula a expressão da síntase de óxido nítrico endotelial, sendo a presença deste necessária para a angiogénese • regeneração de células endoteliais delineando as trabéculas cavernosas • Melhoramento da erecção peniana • (numa situação de oclusão arterial aguda)

17. Utilização de modelos animais • O estudo da expressão de VEGF no animal experimental parece fundamental na regulação destes mecanismos • Possibilidade de manipulação biológica, química e genética, simulando nestes animais os factores de risco para a disfunção eréctil, o que permite o seu estudo in vivo  Extrapolações têm que ser cuidadosas

18. Produto da reacção Anticorpo secundário conjugado com uma enzima Anticorpo primário Imunocitoquímica Célula com antigénio

19. Protocolo Imunocitoquímica: • 1º Dia • Desparafinar em xilol e hidratar em etanol e água • Inibir a peroxidase endógena à temperatura ambiente (TA). • Recuperação antigénica em tampão de citrato • Enxugar lâminas e isolar cortes com Dako pen. • Adicionar tampão de incubação (5% NGS em PBS) • Adicionar Anticorpo primário (1/100) “overnight” a 4ºC

20. Protocolo Imunocitoquímica: • 2º Dia • Adicionar Ab secundário (1/100) a TA • Adicionar complexo Avidina-Biotina (ABC) a TA. • Preparar DAB a 30% H202 e adicionar aos cortes. • Parar reacção com H2O e corar com hematoxilina • Desidratar e montar com Entellan

21. Resultados Fig. 4 Corte de pénis de rato (AT= 40x)

22. Fig. 5 Corte de pénis de rato (AT= 40x)

23. Fig. 6 Corte de pénis de rato (AT= 40x)

24. Fig. 7 Corte de pénis de rato – corpo cavernoso (AT= 200x)

25. Discussão dos resultados • Os corpos cavernosos apresentam marcação preferencial no tecido conjuntivo (sem definição específica). Este tecido apresenta as condições necessárias para a formação de vasos. • O tecido muscular liso não apresenta marcação acentuada • O endotélio apresenta alguma marcação. • Uretra com marcação, mas no lúmen  contaminação (deficiência de lavagem)

26. Perspectivas futuras • Estudos experimentais • Fisiopatologia da erecção • Mecanismos de actuação terapêutica

27. Agradecimentos • Dr. Pedro Vendeira • Dr. Jorge Ferreira • Dra. Delminda Neves • Serviço de Biologia Celular e Molecular

28. Bibliografia • Williams and Warwick; GRAY’S ANATOMY; 38º Edição; Churchill Livingstone, 1995 • Alberts, Bray, Lewis, Raff, Roberts and Watson, Garland Publishing, Inc. "Molecular Biology of the Cell." - 4th ed., New York, 2002. • G.M. Cooper, AMS Press,. "The Cell. A Molecular approach."- 3th ed. U.S.A 2004. Kinsey A, Pomeroy W, Martin C: Sexual behavior in the human Male. Philadelphia: W. B. Saunders Co., 1948 • Feldman H, Goldstein I, Hatzichristou D, et al: Impotence and its medical and phychosocial correlates: results of the Massachusetts Male Aging Study. J Urol 151: 54, 1994 • Siroky M, Azadzoi K: Vasculogenic erectile dysfunction: newer therapeutic strategies. J Urol 170: S24, 2003 • Penson D, Rajfer J, Gonzalez-Cadavid N: Androgen dependence of neuronal nitric oxide synthase content in the rat penis. Endothelium 3: S86, 1995 • Liu X, Lin C, Graziottin T, et al: Vascular endothelial growth factor promotes proliferation and migration of cavernous smooth muscle cells. J Urol 166: 354, 2001 • Murohara T, Asahara T, Silver M, et al: Nitric oxide synthase modulates angiogenesis in response to tissue ischemia, J Clin Invest 101: 2567, 1998 • http://astro.temple.edu/~sodicm/labs/index.htm • http://www.vh.org/adult/provider/anatomy/MicroscopicAnatomy/MicroscopicAnatomy.html