Expresión y purificación de Proteínas de Fusión

1. Genética Molecular 2011 Expresión y purificación de Proteínas de Fusión

2. Tag Mi Proteína Mi Proteína Tag ¿Qué es una proteína de fusión? Es a combinación de una proteína de interés fusionada a otra proteína o péptido conocidos, denominados Tags. Los Tags pueden estar en el NH2 o COOH. ¿Qué herramienta biológica de la síntesis de proteínas se utiliza para crear una proteína de fusión? Básicamente, un mRNA con un marco abierto de lectura (open reading frame, ORF) de codones cualquiera, sin STOPs, puede ser traducido a proteína. Las proteínas de fusión se basan en esta premisa. Codón de inicio: ATG (Met) Codones STOP: TAG, TGA TAA

3. ¿Por qué son importantes las proteínas de fusión?Las técnicas de ADN recombinante revolucionaron la producción y purificación de proteínas. Permite la purificación de la proteína en pocos pasos, y evita purificar proteínas endógenas. ADN recombinante bacterias mucha proteína (o cel. eucariota) Introducción del ADN recombinante en bacterias o línea celular donde se expresa la proteína de fusión Clonado de gen de interés en marco con la secuencia del Tag Fusión de secuencia del gen de interés con secuencia del Tag

4. ¿Qué sistema elegirían para expresar proteínas recombinantes y tener mucha proteína? Lo más común es usar Escherichia coli Ventajas: Se obtiene mucha cantidad de proteína, es fácil de crecer, de inducir y de purificar la proteína de fusión. Desventajas: No realizan modificaciones post-traduccionales, necesarias para el correcto plegamiento y/o actividad de ciertas proteínas. Es posible que no haya un correcto plegamiento de la proteína y haya que pasar a otro sistema (células de mamífero, de insecto, levaduras…).

5. ¿Cuando se debe inducir la expresión de una proteína en bacterias? Fase exponencial (o Log): máxima tasa de división celular; maquinaria transcripcional y traduccional muy activa.

6. Vectores inducibles de expresión en procariotas: se basan en el sistema del operon lac (requerido para el transporte y metabolismo de la lactosa en E. coli)

8. En la práctica: situaciones de represión y activación de la transcripción del gen de interés

9. Sistema pET: doble sistema de inducción; disminuye la expresión “leaky”

10. Cuerpos de inclusión: problema o ventaja? Son agregados insolubles de proteína desnaturalizada. Su formación depende de la naturaleza de la proteína y su nivel de expresión. Son fácilmente purificables (casi todo proteína recombinante), pero para obtener la proteína hay que hacerlo en condiciones desnaturalizantes (urea 8M). Cuerpos de inclusión de β-lactamasa en E. coli.

11. M: marker L: lisado de bacterias F: percolado E: eluído • Las fusiones permiten: • Fácil y rápida purificación de la proteína expresada en bacterias, • basada en las propiedades del Tag (cromatografía de afinidad, anticuerpos).

12. Localización de proteínas en células eucariotas por fusión a proteínas o Tags fluorescentes (microscopía de fluorescencia) o Tags contra los que hay anticuerpos comerciales (inmunofluorescencia). • Las fusiones permiten: • Direccionar la localización de proteínas de fusión en bacterias: • Periplasma: fácil purificación, pocas proteínas contaminantes, ambiente • favorable para el buen plegamiento y la formación de puentes disulfuro. • Secreción al medio: pocas proteínas contaminantes, fácil purificación. • Aumentar la solubilidad de las proteínas de fusión. • Caracterización de proteínas (principalmente en interacciones proteína:proteína; • ensayo de doble hibrido, GST-pull down, co-inmunoprecipitación).

13. Clasificación de Tags (muchos Tags cumplen más de una función) Por afinidad a un ligando (GST) De purificación

14. C O H O C O H O 2 H 2 H N O H N O H H N N H N N 2 2 H H O O O O La proteína de fusión se purifica por cromatografía de afinidad usando glutation inmobilizado sobre agarosa. S H E Glutathione (GSH) Glutathione and electrophile E (toxic products) S -transferase De purificación GST (Glutathione S-Transferase): 26 kDa, originalmente clonada del parásito Schistosoma japonicum. Muy fácil purificación. GST aumenta la solubilidad de la proteína. Ventajas: Elución suave Buen rendimiento Único paso de purificación Desventaja: solo puede realizarse en condiciones nativas

15. Clasificaciónde los Tags (muchos Tags cumplen más de una función) Por afinidad a un ligando (GST) De purificación Por características químicas del Tag (His-Tag).

16. Se purifican por IMAC (Immobilized-metal affinity chromatography) El His-Tag se une a cationes divalentes (el más usado es Ni2+) inmobilizados en la resina. Se eluye compitiendo las histidinas con Imidazol (residuo de la histidina ) De purificación His-Tag: Tag lineal que contiene 4, 6 o 10 Histidinas consecutivas. Es muy pequeño (menor a 1kDa). Permite la purificación aún en condiciones desnaturalizantes (Urea 8M). Se obtiene buen rendimiento de purificación. Único paso de purificación. El Tag no interfiere con el plegamiento ni con la función de la proteína.

17. Purificación en condiciones desnaturalizantes: La proteína expresada se aglutina en “cuerpos de inclusión”. Son agregados insolubles que mayormente contienen la proteína de interés. Pueden ser disueltos usando detergentes suaves y UREA 8M, con la consecuente desnaturalización de las proteínas. Esto puede ocurrir por: Expresión muy alta de la proteína de interés y que esta no se llegue a plegar bien. Proteínas muy poco solubles, no solubles o que tengan pasos transmembrana hidrofóbicos. Proteínas que necesiten modificaciones post-traduccionales para su correcto plegamiento.

18. De purificación His-Tag: Esquema de purificación: Muy usado en expresión en bacterias. Las resinas son reusables. Alto rendimiento.

19. Clasificaciónde los Tags (muchos Tags cumplen más de una función) Por afinidad a un ligando (GST) De purificación Por características químicas del Tag (His-Tag). Por anticuerpos comerciales (T7, FLAG, HA, C-Myc, etc)

20. Purificación por anticuerpos comerciales sobre tags cortos: T7-Tag: derivado del gen 10 del fago T7 que es la proteína más abundante del fago. Secuencia: MASTGGQQMG FLAG: péptido comercial muy inmunogénico. Secuencia: DYKDDDDK HA-Tag: residuos 98-106 del la hemaglutinina del virus de influenza humano. Secuencia: YPYDVPDYA C-Myc: residuos 408-439 del producto del oncogen c-myc humano. Todos estos Tags pueden usarse para purificar las proteínas tanto de bacterias como de células eucariotas transfectadas, usando anticuerpos comerciales. No es lo más recomendable en bacterias en el caso de poder usar fusiones a GST o HIS-Tag.

21. Clasificaciónde los Tags (muchos Tags cumplen más de una función) Por afinidad a un ligando (GST) De purificación Por características químicas del Tag (His-Tag). Por anticuerpos comerciales (T7, FLAG, HA, C-Myc, etc) Secuencias de localización periplásmica (mejora el plegamiento por favorecer formación de S-S). Secuencias que permiten la secreción al medio de cultivo (fácil purificación). De localización en bacterias NusA. Es una de las proteínas más solubles conocidas. De aumento de solubilidad GFP, DsRed. Anticuerpos comerciales contra Tags (FLAG, HA, c-Myc, T7) por inmunofluorescencia. Localización de proteínas

22. Localización de proteínas GFP (Green Fluorescent Protein): Provenie de la medusa Aequorea victoria. GFP es una proteína muy estable de 238 aa. Cuando se expresa en células eucariotas o procariotas, y es iluminada por luz azul o UV, emite fluorescencia verde brillante (energía de una fuente lumínica es absorbida y reemitida). La fluorescencia de GFP es independiente de la especie que la expresa, no necesita cofactores, sustratos u otros productos génicos de A. victoria. Ampliamente usada como proteína de fusión o gen reportero. Hay variantes de GFP logradas por mutaciones puntuales.

23. Ratones que expresan GFP en todas sus células Proteína de fusión expresada en levaduras Localización de proteínas GFP (Green Fluorescent Protein): Puede usarse para ”taguear” proteínas individuales en células vivas, y hasta 2 o más proteínas distintas en una misma célula con las variantes de GFP. No modifica la localización de su proteína “partner”. Usada en todos los organismos, desde levaduras hasta mamíferos.

24. Localización de proteínas • DsRed (Proteína Roja Fluorescente): • Proviene del coral de arrecife Discosoma sp. • Muy usado últimamente como marcador de células y como tag de fusión. • Comparte las mismas características con GFP. • A través de mutaciones en la secuencia de AA se han podido crear variantes • de absorción y emisión muy útiles para usar más de un tag por célula. mHoneydew mBanana mOrange tdTomato mTangerine mStrawberry mCherry

25. Localización de proteínas Tags cortos contra los que existen anticuerpos comerciales: Inmunofluorescencia indirecta: 1°. Anticuerpo primarios (mAb) 2°. Anticuerpo secundarios conjugados a fluoróforos FLAG, HA, c-Myc, T7 Permiten ver localización subcelular de proteínas fusionadas a estos Tags (solo en células fijadas = MUERTAS); los anticuerpos deben ser introducidos dentro de las células).

26. Volviendo a las proteínas recombinantes... Muchas veces se necesita eliminar el Tag de la proteína de interés

27. PDI TAG Corte de los Tags secuencia de clivaje por proteasas incluída Obtención de la estructura primaria nativa de la proteína por corte con una proteasa. Secuencia de clivaje entre el Tag y la proteína de interés.

28. Esquema de obtención de proteínas nativas clivadas del Tag

29. Por hoy ya es suficiente…