Barrieren der Organe – die intelligenten Grenzen des Körper (Tight Junctions)

1. Barrieren der Organe – die intelligenten Grenzen des Körper (Tight Junctions) 12.02.2010 Susanne Krug Institut für Klinische Physiologie Campus Benjamin Franklin, Charité Berlin DFG-Forschergruppe 721

2. Gliederung • Der transepitheliale Widerstand  Chopstick-Elektroden •  Die Ussing-Kammer •  Impedanzspektroskopie: • Ein-Wege-Impedanzspektroskopie • Zwei-Wege-Impedanzspektroskopie • Conductance Scanning (Voltage Scanning) • Zusammenfassung

3. Der transepitheliale Widerstand • Transepithelialer Widerstand (Rt, TER) gibt Kehrwert aller Ionenpermeabilitäten an • Kehrwert = transepitheliale Leitfähigkeit (Gt) Einheit: mS/cm² Einheit: cm² • Gtist proportional zur Fläche  mit Flächenzunahme sinkt Rt • allgemeine Rt-Bestimmung: • - Anlegen eines Stromimpulses I  Spannungsänderung V •  Ohm'sches Gesetz: R = V / I • beeinhaltet Widerstände des Epithels, der Bad- lösung, des Subepithels, bzw. Supports [mmol/l]

4. Chopstick-Elektroden • Anlegen zweier Elektrodenpaare (I-Amplikation; V- Messung) • + einfache und schnelle Messung  Screening der Konfluenz und Widerstandsentwicklung • + beliebig oft wiederholbar • - positionsabhängige Werte (Nähe zu Zellen; Rand vs. Mitte) • - ungerührte Lösung  Konzentrationsgradienten •  Beeinflussung von Fluxen und resultierenden Permeabilitäten • - AC-Strom-betrieben  Kurzschluss der ohm'schen Zellelemente  unterschätzter Rt • (- nicht-temperierte Platten  keine Langzeitmessung möglich)

5. Die Ussing-Kammer • Vier-Elektrodensystem (I-Amplikation; V-Messung) • Generation eines fast homogenen Stroms (DC-Strom) •  wirkt auf gesamten Zelllayer • V wird nahe der Probe detektiert • Begasung  Badlösung permanent durchmischt •  Versorgung des Epithels mit O2 und CO2 •  Langzeitexperimente möglich • Kurzschluss-Technik (ISC) über Spannungsklemme: • - V wird auf 0 V geklemmt • - Aktiver Transport, z.B. Na+ ISC

6. Beispiel: Transport am Rindercolon AMIL (mu) = Amilorid  hemmt Aldosteron-abhängige Na+-Aufnahme (ENaC) Ba++ (mu)  hemmt K+-Ausstrom THEO (bds.) = Theophillin  cAMP-Anreicherung  Stimulation der Cl–-Sekretion FURO (se) = Furosemid  Inhibition der Cl--Sekretion (Na+K+2Cl–-Symporter) Hegel et al., 1993, Am. J. Physiol.

7. Ein-Wege-Impedanzspektroskopie • Impedanzmessung bei Wechselstrom (AC-Messung; 1 Hz bis 65 kHz): • Frequenz  0:Kondensator Cepi ist nicht leitfähig  Repi + Rsub = "TER" • Frequenz  : Kondensator Cepi ist leitfähig, so dass Widerstand Repi kurzgeschlossen ist  nur Rsub Biologisches Modell:6-Parameter Zusammengefasstes Modell:3-Parameter Repi Rsub

8. Beispiel: Morbus Crohn Ileum, CTRL Entzündung£ Barriere¤ Ileum, Crohn Rt(TER): -10%Repi: -50% Claudin-2 : £Claudin-5 : ¤Claudin-8 : ¤ Zeissig et al., 2004, GutZeissig et al., 2007, Gut

9. Zwei-Wege-Impedanzspektroskopie Ziel: Direkte Messung des para- und transzellulären Widerstands Messung von zwei zusätzlichen Parametern: 1.Rpara-Perturbation EGTA Ca2+-Switch 2.Quotient der Permeabilitäten für einen parazellulären Marker vor und nach Rpara-Perturbation, z.B. für Fluorescein Repivor EGTA Biologisches Modell:6-Parameter Zusammengefasstes Modell:4-Parameter Repinach EGTA Rsub Krug et al., 2009, Biophys. J.

10. Zwei-Wege-Impedanzspektroskopie Ziel: Direkte Messung des para- und transzellulären Widerstands Messung von zwei zusätzlichen Parametern: 1.Rpara-Perturbation EGTA Ca2+-Switch 2.Quotient der Permeabilitäten für einen parazellulären Marker vor und nach Rpara-Perturbation, z.B. für Fluorescein Biologisches Modell:6-Parameter Zusammengefasstes Modell:4-Parameter EGTA

11. Zwei-Wege-Impedanzspektroskopie Voraussetzung: Linearer Zusammenhang zwischen Flux des Markers und Leitfähigkeit  Muss für jede Zellart zuvor validiert werden • Änderungen von Rtrans • Verschiebung entlang der y-Achse • Änderungen von Rpara • Steigungsänderung

12. Beispiel: Claudin-10b PFluo PCl PNa Gepi • Cld10b in MDCK C7 transfiziert  Kationenpore • linearer Zusammenhang von Gepi zu PX sowohl für Na+ als auch Cl- und Fluorescein mit gleichem Gtrans • PNa > PCl > PFluorescein Günzel et al., 2009, J. Cell Sci.Krug et al., 2009, Biophys. J.

13. Beispiel: Forskolin • apikale Gabe von Forskolin  Änderung der apikalen Membran (Doppelbogen) •  Rtrans verändert • zusätzliche EGTA-Gabe  Rpara verändert

14. Conductance-Scanning (Voltage Scanning) Variable Auflösung: gering: Ulcus-Bereiche Single-cell wound repair Colonoberfläche / Krypten Focal leaks (durch Bakterien) Apoptosen Hoch: trans- / parazellulär • Messung lokaler Unterschiede der Strom- dichte über der apikalen Membran • AC-Clamp (200 µA/cm², 24 Hz) • detektierte Signale im µV-Bereich • Berechnung des Leitfähigkeitsverteilung über best-fit-Algorithmen Köckerling & Fromm, 1992, Am. J. Physiol.Gitter et al., 1997, Pflügers Arch.

15. Beispiel: MDCK C11-Zellen MDCK-C11 cellsGc 2.6 mS/cm2 = Rtrans385 cm2Gpara 10.5 mS/cm2 = Rpara 95 cm2 Gepi 13.1 mS/cm2 = Repi 76 cm2 TJ Gitter et al., 1997, Pflügers Arch.

16. Zusammenfassung •  Bestimmung Repi und Rsub: Ein-Wege-Impedanzspektroskopie •  Bestimmung Rtrans und Rpara: Zwei-Wege-Impedanzspektroskopie •  Räumliche Lokalisation: Conductance-Scanning Rt = Repi + Rsub 1/Repi = 1/Rtrans + 1/Rpara  Gepi = Gtrans + Gpara = Gtrans + k  JFluorescein •  genauere Rt-Bestimmung: Ussing-Kammer •  grobe Rt-Bestimmung: Chopstick-Elektroden

17. Institut für Klinische Physiologie Michael Fromm Dorothee Günzel Salah Amasheh Detlef Sorgenfrei Hans UssingKopenhagen1911 - 2000