Biomembrány

1. BENG - membrány Biomembrány 4.ročník biochemie

2. BENG-membrány Membrány a buňka Obecné vlastnosti a struktura

3. BENG-membrány Buněčné membrány Rostlinná buňka (lilie) Živočišná buňka (jaterní)

4. BENG-membrány Membrány - struktura

5. BENG-membrány Membrána - model

6. BENG-membrány Membrány přeměnující energii * na těchto membránách je syntetizován největší podíl ATP (něco málo i v cytoplazmě) * obsahují 2 odlišné typy protonových pump 1) PRIMÁRNÍ - velmi různorodé podle zdroje energie 2) SEKUNDÁRNÍ - vysoce konzervované - oba systémy jsou velmi těsně spřaženy TYPY: * plasmatická membrána prokaryot * vnitřní membrána mitochondrií * membrány thylakoidů v chloroplastech

7. BENG-membrány Přehled membrán Přehled membrán (P = positive, strana kam jsou protony čerpány)

8. BENG-membrány Chemiosmotická teorie - základ „Hypotetický“ thylakoid - chemiosmotické spřažení přenos protonů a syntézy/hydrolýzy ATP Přídavek ATP = čerpání protonů Ustavení rovnováhy • Odstranění ATP • = tok protonů ven a syntéza ATP (užitečná práce) • pokud pracuje prim.pumpa • 2) pokud spotřeba ATP a přísun ADP/P • Dynamická rovnováha (reverzibilita reakcí a toků) • systém nekoná užitečnou práci

9. BENG-membrány Tok elektronů a protonů Tok protonů -analogie elektrických obvodů s tokem e- p  V JH+ I CMH+  vodivost „ATPasa - spotřebič protonového proudu“

10. BENG-membrány Vlastnosti membrán Důležité vlastnosti membrán: a) resistence průchodu protonů(„protonový odpor“) „protonofory“ (uncouplers, rozpojovače) - pozorovány dávno před Mitchellem - způsobují „zkrat“ v obvodu protonů b) transportní systémy pro metabolity * transport negativně nabitých látek látky do MTCH * současný přenos s H+ nebo OH-

11. BENG-membrány Mitochondrie 1 Mitochondriální a submitochondriální částice Klasický „obraz“ – zmrazené preparáty a TEM

12. BENG-membrány Mitochondrie 1 Mitochondriální a submitochondriální částice - dynamicky se měnící tvar v různých typek buněk podle jejich aktivity - těsný kontakt s ER (intenzivní výměna Ca2+ iontů ) - malý kontakt mezi kristami a mezimembránovým prostorem (měření HREM a 3D modely PT)

13. BENG-membrány Mitochondrie - jak je neznáme ... Pohled shora: Lamelární topologie 4 segmentovaných krist mezi vnější a vnitřní membránou Boční pohled: Otvory spojů krist (černě) spojují mezimembránový prostor s intrakristálním prostorem Elektronová tomografie mitochondrií (National Center for Microscopy and Imaging Research at UCSD) http://www.sci.sdsu.edu/TFrey/MitoMovie.htm

14. BENG-membrány Mitochondrie - jak je neznáme ... 3D model MTCH (krysí játra) - interkonektivita krist - tubulární tvar Normální Myopatie • Nové otázky: • - gradienty metabolitů (ADP) v kristách ? • - izolované kulovité kristy ? • vztah k patologickým vztahům ? • propojení MTCH / EPR

15. BENG-membrány Mitochondrie 2 Mitochondrie v různých typech buněk: NEURONY - diskrétní filamenta v cytoplazmě - mobilní podél axonů a dendritů difúzní koeficient ~0.8 µm2/s (2-4x pomaleji než v roztoku) SVALOVĚ BUŇKY - velké množství krist

16. BENG-membrány Mitochondrie - sval Mitochondrie svalových buněk

17. BENG-membrány Mitochondriální membrány - vnější nespecifické póry pro metabolity < 10kDa „poriny“ (VDAC, voltage dependent anion channels) x není membránový potenciál - vnitřní„energy transducing“ - dýchací řetězec a ATPasa speciální transportní mechanismus pro proteiny značení orientace membrány: N-side (negative): do matrix P-side (positive): do mezimembránového prostoru POZOR: u submitochondriálních preparátů přípravených sonikací dochází k inverzi!!

18. BENG-membrány Respirující baktérie Gram-negativní bakterie (velikost cca jako MTCH) * membrána oddělena od peptidoglykanové stěny periplasmem Gram-pozitivní bakterie * membrána přiléhá přímo k vnější buněčné stěně ROZDÍLY: - mnoho látek neprochází vnější membránou Gram-negativních - ADP/ATP a NAD+/NADH neprochází cytoplasmatickou membránou - obtížné „vyhladovění“ - odstranění vnitřních substrátů - studium transportu metabolitů komplikováno jejich možnou přeměnou

19. BENG-membrány Membrána Gram-negativní baktérie

20. BENG-membrány Chloroplasty

21. BENG-membrány Chloroplasty - thylakoid velikost: 4-10 m průměr, 1-2 m tlouštka

22. BENG-membrány Membrána thylakoidů - lumen tvoří oddělený prostor od mezimembránového prostoru - ATP a NADPH používány ve stroma k fixaci CO2 - „broken chloroplast“ - bez vnější membrány a stromatu

23. BENG-membrány Purpurová baktérie Rhodobacter Nejstudovanější skupina: a) tvorba „chromatoforů“ b) snadné studium * malá velikost * opticky jasné suspenze c) snadná izolace reakčních center

24. BENG-membrány Obecné vlastnosti • Lipidická dvojvrstva membrán: • nepropustná pro většinu iontů včetně H+ • vysoký odpor (potenciál 200mV = elektrické pole 3.105 V/cm-1) • B) propustná pro řadu nenabitých látek • 02, CO2, NH3, octanový anion (využito pro studium pH gradientů) • C) polární molekuly vody:aquaporiny • = vodupropustné kanály (Peter Agre – Nobelova cena 2003)

25. BENG-membrány Aquaporiny

26. BENG-membrány Transport iontů • - Transport iontů integrální součást chemi-osmotické teorie • Membrány přeměňující energii mají obecně shodné vlastnosti jako všechny ostatní buněčné membrány • Pro transport musí existovat hnací síla • Typy transportu: • Difúze lipidickou vrstvou x přenašeč (ionofor, protein) • Pasivní přenos x energetické spřažení (aktivní transport) • Jediný ion x spřažený přenos 2 a více iontů • Dochází k výslednému přenosu náboje ?

27. BENG-membrány Transport iontů 1

28. BENG-membrány Transport iontů 2

29. BENG-membrány Specifika energetických membrán 1 • Ad 1) difúze x přenašeč • Proteinové složení • Vnitřní MTCH: 50% plochy integrálníproteiny!! • 25% periferální proteiny, 25% lipidy • - přenašeče v MTCH krysích játer x nejsou v MTCH srdce • Lipidové složení • * Vnitřní MTCH: 20% kardiolipin (fosfolipid) • - vysoká elektrická izolace, struktura, náboj • x Barthův syndrom • * Thylakoid: 16% kardiolipin • 40% galaktolipidy • 40% fotopigmenty kardiolipin

30. BENG-membrány Specifika energetických membrán 2 Ad 2) pasivní x spřažený transport Pro stejný iont existují různé mechanismy ! * sarkoplasmatické retikulum – iontová pumpa Ca2+ - ATPasa * vnitřní MTCH membrána – uniport pro Ca2+/Na+ poháněný  „Aktivní“ transport – pouze přenos katalyzovaný proteiny může být přímo spřažen s metabolismem

31. BENG-membrány Specifika energetických membrán 3 Ad 3) uniport, symport a antiport Příklady: Bakteriální membrána: symport H+/metabolity do buňky Lipidické dvojvrstvy: antiport K+/H+ s nigericinem Obtížné experimentální rozlišení H+/OH- např. fosfátový přenašeč je P-/OH- antiport nebo P-/H+ symport ? Jeden ion se může účastnit více blízce spjatých drah: Na+ uniport (kanály aktivované membránovým potenciálem) Na + symport (ko-transport s glukosou) Na + antiport (přenašeč 3Na+/Ca2+)

32. BENG-membrány Specifika energetických membrán 4 Ad 3) elektroneutrální x přenos náboje Celkově elektroneutrální přenos x na molekulární úrovni dochází k neustálému přenosu náboje Jedna dráha přenosu se může podle podmínek chovat jako: elektrogenní = vytvářející elektrický potenciál na membráně elektroforetická = přenos iontů na úkor elektrického potenciálu

33. BENG-membrány Ionofory • Funkce ionoforu = snížení aktivační energie potřebné pro zanoření polární látky do nepolární lipidické vrstvy • a) Přírodní – antibiotika • b) Syntetické – studium vlastností membrán a transportu iontů • látky MW cca 500-2000 Da, hydrofobní povrch a hydrofilní jádro • Mechanismus: • mobilní přenašeče: rychlost cca 1000 iontů/s-1, vysoká specifita pro ionty, ovlivněny fluiditou membrány • tvorba kanálů: nízká diskriminace mezi ionty x vysoká rychlost cca 107 iontů/s-1

34. BENG-membrány Přenos náboje bez přenosu H+ Valinomycin(Streptomyces) * (L-Val-D-hiVA-D-Val-D-Lac)3 * uniport Cs+, Rb+, K+, NH4+ * přenos Na+ - 104 x menší než K+ * volný Val i nabitý komplex prochází membránou * katalytická účinnost 10-9 M Gramicidine * přechodná tvorbu dimerů - kanály * nízká selektivita pro jednomocné kationty * rychlost limitována pouze difúzí (cca 107 iontů/s-1) HCO-L-Val-Gly-L-Ala-D-Leu-L-Ala-D-Val-L-Val-D-Val-L-Trp-D-Leu-L-Trp-D-Leu-L-Trp-D-Leu-L-Trp-NHCH2CH2OH

35. BENG-membrány Valinomycin a gramicidin – přenos iontů

36. BENG-membrány Ionofory pro Ca2+ A23187 *vysoká afinta pro Ca2+ Calcium ionophore IV (Sigma)

37. BENG-membrány Přenos H+ bez přenosunáboje Nigericin * tvorba hydrofilní kapsy O-heterocykly * při vazbě kationtu ztrácí H+ * obě formy prochází membránou Monensin * preference pro Na+

38. BENG-membrány Protonofory - přenos H+ a náboje FCCP= carbonylcyanide-p-trifluoromethoxyphenyl-hydrazone • „rozpojovače, přenašeče H+“ • průchod díky systému -elektronů • zvýšení propustnosti membrány pro protony vede ke zkratu obvodu a rozpojení tvorby p od syntézy ATP • zvýšení protonové vodivosti těmito látkami bylo v souladu s chemiosmotickou teorií • rozpojení může být dosaženo kombinací ionoforů • např. valinomycin a nigericin

39. BENG-membrány Příklady funkce – nigericin a FCCP c) Elektroneutrální přenos H+ d) Cyklování protonoforu

40. BENG-membrány Lipofilní kationty a anionty • TPP+ = tetrafenylfosfoniový kation • TPB- = tetrafenylborátový anion • Využití schopnosti -elektronů „odstiňovat“ elektrický náboj při průchodu lipidickou dvojvrstvou • VÝZNAM: • nejsou ionofory, ale akumulují se při existenci membránového potenciálu = experimentální odhad  • fluoreskující lipofilní kationty – sledování MTCH in vitro i v živých buňkách

41. BENG-membrány TPP a TPB TPP+ TPB-

42. BENG-membrány Transportní proteiny • Specifika: • Analogie enzymům(inhibice, stereospecifita, genetika) • Individuální, orgánová a tkáňová odlišnost (např. citrátový přenašeč – pouze jaterní MTCH) • Používání synonym pro transportní proteiny: • „Přenašeče“ x neodpovídá funkci přenašeče definované u ionoforů • „Permeasy“, „Translokasy“ • - Většina transportních proteinů tvoří dimery a přenos látek se děje konformačními změnami proteinů

43. BENG-membrány „Kyvadlová doprava MTCH- CYT“

44. BENG-membrány Osmotické bobtnání MTCH Základní princip: pouze malé odchylky od rovnovážného rozdělení iontů – vznik velkých potenciálů (1 nmol iontu =  >200mV) a) probíhá vždy, pokud nejsou MTCH v isotonickém prostředí, které navíc neobsahuje permeabilní ionty b) zahrnuje rozvinutí vnitřní membrány až do prasknutí vnější membrány c) pozoruje se jako změny optických vlastností suspenze MTCH

45. BENG-membrány Bobtnání MTCH – ionofory a metabolity 1 1) nepropustnost Cl-

46. BENG-membrány Bobtnání MTCH – ionofory a metabolity 2 1) nepropustnost Cl- 2) propustnost SCN-

47. BENG-membrány Bobtnání MTCH – ionofory a metabolity 3 1) nepropustnost Cl- 2) propustnost SCN- 3) reflux H+ po FCCP

48. BENG-membrány Bobtnání MTCH – ionofory a metabolity 4-5 5) srovnej s nigericinem 4) FCCP nutný pro H+ tok

49. BENG-membrány Bobtnání MTCH – ionofory a metabolity 6-7 7) kontrakce po přídavku nigericinu a substrátu: propustnost pro NO3- 6) propustnost pro acetát

50. BENG-membrány Fyziologický význam bobtnání MTCH • Přídavek TNF- ke kultuře lidských hepatocytů: • Tvorba ROS (změna červená – žlutá-zelená barva) • Bobtnání MTCH = změny v propustnosti vnitřní membrány