ANALISI PROTEICA

1. ANALISI PROTEICA La forte affinità e specificità di legame tra antigeni ed anticorpi è sfruttata anche in tecniche di “blotting” di proteine per la rivelazione di proteine di interesse diagnostico e clinico. Western blots e dot blots sono le tecniche più comunemente usate.

2. (a) (b) (c) streptavidin biotin second anti-species antibody CL molecule product unlabeled detection antibody detection antibody enzyme protein ANALISI PROTEICA Western Blot analisi: Dot Blot analisi: La differenza con il western blot consiste nel fatto che le proteine non sono separate per via elettroforetica, ma sono depositate direttamente sulla membrana.

3. ANALISI GENICHE La ricerca di specifiche sequenze geniche ha una grande importanza in ambito clinico e diagnostico in quanto l’identificazione della sequenze genica associata ad un determinato effetto permette di individuarne le cause. L’isolamento e la quantificazione di sequenze di acidi nucleici e lo studio della loro organizzazione, localizzazione, ed espressione è reso possibile da: - marcatura di acidi nucleici per produrre DNA/RNA sonda - fenomenmo di autoduplicazione; ibridazione

4. DNA Struttura secondaria del DNA: doppia elica con uno scheletro idrofilo zucchero-fosfato e basi idrofobiche impacchettate perpendicolarmente all'asse dell'elica. I due filamenti di DNA complementari si sviluppano in direzione opposta. Struttura primaria del DNA: sequenza di basi nucleotidiche (adenina, guanina, citosina, timina) contenente l’informazione genetica, legate fra di loro attraverso i ponti della catena zucchero-fosfato.

5. DNA Stabilità del DNA: La doppia elica è stabilizzata dalla formazione di legami ad idrogeno tra le basi presenti sui filamenti opposti secondo lo schema A-T e G-C:

6. IBRIDAZIONE DI ACIDI NUCLEICI • IN VIVO: alla base dei processi di riconoscimento molecolare • IN VITRO: l’ibridazione di sequenze target con sonde oligonucleotidiche è l’approccio tipico per l’identificazione e l’isolamento di acidi nucleici Denaturazione del DNA target con trattamento termico per rompere i legami H Mix frammenti sonda + target per far avvenire l’appaiamento di sequenze complementari

7. IBRIDAZIONE DI ACIDI NUCLEICI

8. STABILITA’ DELL’IBRIDO Temperatura di melting Tm • Tm = temperatura alla quale il 50% del DNA (o ibrido) è presente in forma denaturata; cioè come singolo filemanto • È un indice della stabilità del legame chimico • La denaturazione del Dna provoca una variazione delle proprietà spettroscopiche

9. IBRIDAZIONE • L’ENERGIA necessaria per separare due filamenti complementari di DNA dipende da: • LUNGHEZZAdei filamenti (più sono lunghi più energia occorre) • COMPOSIZIONEdi basi azotate (la coppia GC possiede un legame idrogeno in più rispetto alla coppia AT, quindi filamenti ricchi in GC richiedono maggiore energia per esserseparati) • COMPLEMENTARIETA’ delle catene di DNA:catene non perfettamente complementari fra di loro (con una o più basi “mismatched”) si legano ugualmente, ma con energia minore. • AMBIENTE CHIMICO(la presenza di cationi monovalenti quali Na+ stabilizza la doppia elica, i denaturanti quali urea e formamide la destabilizzano) DK = e-G(complementare/non complementare)/RT G(complementare/non complementare)~4 kcal/mol DK ~ 1/100-1/1000

10. REAZIONI D’IBRIDAZIONE La reazione d’ibridazione procede con una cinetica del secondo ordine a due stadi. La sensibilità delle reazioni di ibridazione è molto elevata (costante di associazione delle sonde = 1015 /mole) La specificità delle reazioni di ibridazione è alta. La complementarietà tra la sequenza di basi della sonda e dell’acido nucleico bersaglio è necessaria. Per la rivelazione delle reazioni d’ibridazione occorre marcare il DNA sonda. I metodi di marcatura degli acidi nucleici prevedono l’incoroporazione di nucleotidi marcati nel DNA, mediante reazioni enzimatiche o durante il processo di sintesi.

11. SONDE GENICHE • Una Sonda di DNA (RNA) è un frammento di DNA/RNA marcato che viene utilizzato per identificare sequenze specifiche di acidi nucleici • Le sonde sono di diverse dimensioni: oligomeri (contenenti meno di 50 basi) o frammenti di alcune migliaia di nucleotidi. • Può essere a singolo o a doppio filamento, anche se prima di esser usata viene convertita a singolo filamento

12. MARCATURA IN VITRO • Marcatura di un filamento con DNA Polimerasi (nel corso della sintesi del DNA vengono incorporati nucleotidi marcati) • • NICK TRANSLATION • • RANDOM PRIMING • Marcatura terminale (aggiunta di un gruppo marcato ad uno o più nucleotidi terminali) • Marcatura di RNA

13. MARCATURA ISOTOPICA Attraverso la marcatura diretta, Il marcatore è legato covalentemente direttamente all’acido nucleico, o intercala con legami non covalenti direttamente tra la doppia elica del DNA sonda. Le sonde radioattive, sonde “calde”, contengono nucleotidi in cui è inserito un radioisotopo (es. 32P, 35S, 3H) che viene individuato in soluzione o tramite autoradiografia Le sonde “calde” sono le più sensibili.

14. MARCATURA NON ISOTOPICA Le sonde non radioattive sono dette sonde “fredde”. La marcatura Non radioattiva può essere diretta o indiretta. I vari tipi di marcatori sono: • Composti chemiluminescenti: luminolo e derivati • Enzimi: fosfatasi alcalina, luciferasi batterica o da lucciola, HRP, … • Inibitori enzimaticic: acido fosfonico • Composti fluorescenti: fluorescina, rodamina, chelati di europio • Fotoproteine: acquorina

15. MARCATURA NON ISOTOPICA CL molecule product enzyme gene probe target sequence MARCATURA DIRETTA Per metodi basati sull’utilizzo di sonde più lunghe di 300 basi, la marcatura diretta con AP o HRP è consigliata, in questo modo la formazione dell’ibrido è rivelata semplicemente aggiungendo il substrato chemiluminescente per l’enzima. La marcatura enzimatica permette l’amplificazione del segnale, la luminescenza permette di sviluppare metodi sensibili per la rivelazione di quantità piccole di acidi nucleici.

16. MARCATURA NON ISOTOPICA MARCATURA INDIRETTA Sebbena la marcatura diretta di sonde relativamente corte con enzimi sia stata presentata, la presenza di un enzima legato ad una sonda di piccole dimensioni può inficiare la cinetica e la specificità della reazione d’ibridazione. La marcatura con apteni permette sempre lo sviluppo di sistemi amplificati (es. biotina-avidina, biotina-streptavidina) Sonde geniche di piccole dimensioni sono spesso marcate indirettamente con apteni che sono poi immunorivelati attraverso anticorpi anti-aptene marcati con l’enzima anti-hapten antibody hapten

17. MARCATURA NON ISOTOPICA Mediante marcatura indiretta: una opportuna specie chimica (di solito un aptene) viene legata covalentemente alla sonda genica, ed al momento opportuno questa specie viene rivelata attraverso il suo legame con una adatta molecola di legame marcata con il tracciante.

18. MARCATURA NON ISOTOPICA Una scoperta relativamente recente che permette la rivelazione di specifiche sequenze geniche è rappresentata dai “molecular beacons”. Esse sono sonde oligonucleotidiche che rivelano la presenza di una specifica sequenza target (DNA o RNA) attraverso l’emissione di un intenso segnale fluorescente a seguito della reazione di ibridizzazione. I “molecular beacons” sono oligonucleotidi a filamento singolo con struttura “STEM-LOOP”,Alle estremità della porzione “STEM” sono legate rispettivamente una molecola fluorescente ed un “quencher”. sequenza target LOOP STEM fluoroforo “quencher”

19. METODI DI RIVELAZIONE Colorimetry. Colorimetric assays produce soluble colored products and are relatively insensitive compared to luminescent assays; simple visual read-out Fluorescence and time-resolved fluorescence. Capable of detecting single molecules of fluorescein; High background signal due to nonspecific fluorescence present in biological samples Since the background fluorescence tends to be short-lived, it can be avoided by using a short lived fluorophore, e.g. europium chelate Electrochemiluminescence. An electrochemical reaction produces excited-state species that decay to produce ground state product and light; need for specialized equipment that combines electrochemical-generation and light-detection capabilities

20. METODI DI RIVELAZIONE Chemiluminescence and Bioluminescence. Chemiluminescence is the emission of light that occurs in certain chemical reactions because of decay of electronic excited molecules to the ground state; bioluminescence is the chemiluminescence of nature (e.g. the firefly photinus pyralis) Both methods are very sensitive (zeptomole amounts, 10-21 moles) rapid and versatile (adaptable for hybridization in solution and on membranes and monitoring with Charge Coupled Device cameras). Phosphorescence. Long-lived emission from triplet excited states (e.g. inorganic phosphor crystals); Irradiation with ultraviolet light results in a long-lived signal (milliseconds to microseconds); Signal acquisition using photographic film or a CCD camera

21. RIVELAZIONE DEI MARCATORI NON ISOTOPICI Aequorin (apoaequorin produced by recombinant DNA techniques is converted to aequorin (the photoprotein present in the jellyfish Aequora) by reaction with coelenterazine and light emission from aequorin is triggered by calcium ions, light is emitted as a flash (469 nm) Alkaline Phosphatase • Chemiluminescent: AMPPD (adamantyl 1,2-dioxetane aryl phosphate) is dephosphorylated to a phenoxide intermediate which decomposes to form adamantone and an exited-state aryl-ester, which emits light as a protracted glow • Bioluminescent: firefly luciferin O-phosphate luciferin • Colorimetric, time-resolved fluorescent AP

22. RIVELAZIONE DEI MARCATORI NON ISOTOPICI Europium chelates: lanthanides, e.g. europium 3+ and terbium 3+ form highly fluorescent chelates with naphthoyltrifluoracetone. Long-lived fluorescence (100-1000 us) Fluorescein: (quantum yield bigger than 0.85) used in nonseparation energy transfer probe assays Glucose-6-phosphate dehydrogenase: used with marine bacterial luciferase NAD(P)H:FMN oxidoreducatse reaction Horseradish peroxidase: catalyzes the chemiluminescent oxidation of luminol and, in the presence of small amounts of phenols and amines the analytical features of this reaction are enhanced. The light emission from this reaction is a long-lived glow (>30 min)

23. RIVELAZIONE DEI MARCATORI NON ISOTOPICI Luminol and Isoluminol: metal ions and peroxidases catalyze the chemiluminescent oxidation of luminol and isoluminol Phosphors. protein Acan be labeled with red-emitting yttriumoxisulfide or green-emitting zinc silicate phosphors (southern and dot blots). Phosphorescence signal is not influenced by the presence of water, pH or changes in temperature Renilla Luciferase: catalyzes the bioluminescent oxidation of coelenterazione.Light is emitted as a glow Xanthine oxidase: catalyzes the luminescent oxidation of luminol. Long-lived light emission (lasting for several days) is enhanced by an iron-EDTA complex via hydroxyl radical production

24. TECNICHE DI IBRIDAZIONE Le reazioni d’ibridazione sono reazioni bimolecolari fra una molecola “target” ed una molecola “sonda” in cui catene complementari di acidi nucleici si associano a formare molecole a doppia catena sulla base della complementarietà di sequenza. L’ibridazione può avvenire: - in soluzione - in fase mista (ibridazione su filtro) - in situ

25. IBRIDAZIONE IN SOLUZIONE Sonda biotinilata + Micropiastra streptavidinata Questo tipo di reazione d’ibridazione è il più efficace:il bersaglio denaturato e la sonda marcata vengono miscelati in soluzione. I tempi d’ibridazione sono accelerati. L’inconveniente è quello di dover separare l’ibrido formato dalla sonda che non ha reagito. Sono state ideate tecniche che prevedono la cattura dell’ibrido formatosi in soluzione su un supporto solido; generalmente la sonda contiene un ligando, tipo biotina che permette la cattura su un supporto solido. Es: PCR-ELISA

26. IBRIDAZIONE IN SOLUZIONE La PCR-ELISA permette la rivelazione degli ibridi formati in soluzione grazie alla cattura su micropiastre. hapten Il metodo PCR-ELISA prevede che: Il DNA bersaglio viene marcato con un aptene appropriato tramite tecnica PCR. Quindi l’ibridazione con un DNA sonda marcato con biotina avviene in soluzione, quindi l’ibrido è catturato su piastre ricoperte di streptavidina. Quindi gli ibridi sono rivelati attraverso l’uso di un anticorpo anti-aptene coniugato con un enzima e l’aggiunta del substrato opportuno. target DNA PCR anti-hapten antibody

27. IBRIDAZIONE SU FILTRO • I filtri utilizzati possono essere di materiale diverso. • Tra i più usati ci sono: • Nitrocellulosa • -Nylon • -Nylon carico positivamente L’ibridazione su filtro prevede 5 passaggi: 1)fissaggio dell’acido nucleico denaturato su filtro; 2)preibridazione per bloccare i siti sulla membrana; 3)ibridazione, si fa incubare la membrana con la sonda marcata; 4)lavaggi, per rimuovere l’eccesso di sonda; 5)rivelazione dell’ibrido in base al tipo di sonda marcata usata. Le principali tecniche d’ibridazione su filtro sono: - “southern Blotting” - “Dot-Blot” - “Reverse dot-blot”

28. IBRIDAZIONE SU FILTRO Per un’analisi di Southern Blotting: Il DNA è isolato da cellule o tessuti e diviso in fgrammenti di diverse dimensioni con enzimi che tagliano il DNA a siti spoecifici. I vari frammenti sono separati in base alla dimensioni mediante elettroforesi su gel. I frammenti sono poi denaturati per ottenere I singoli filamenti che devono reagire con le sonde complementari. I singoli frammenti sono trasferiti su una membrana di nitrocellulosa e analizzati per ibridazione con una sonda marcata La sonda che non ha reagito è eliminata tramite lavaggi • RNA – Northern Blotting • Protein – Western Blotting

29. IBRIDAZIONE SU FILTRO

30. IBRIDAZIONE SU FILTRO La tecnica Dot-Blot è simile alla Southern Blot in termini di utilizzo di una sonda genica marcata. La differenza consiste nel fatto che i differenti campioni di acidi nucleici (DNA o RNA) non vengonoi separati per via elettroforetica ma sono depositati direttamente su filtro per poi essere ibridati con una sonda marcata. La tecnica Reverse-Blot è una modifica della Dot-Blot tradizionale: sul filtro, infatti, viene fissata la sonda non marcata che viene fatta ibridare con una soluzione d’ibridazione contenente il bersaglio precedentemente marcato.

31. IBRIDAZIONE SU FILTRO La tecnica Reverse Dot Blot sfrutta una sonda non marcata immobilizzata su una membrana. Il DNA bersaglio è prodotto in modo tale da essere marcato con uno specifico aptene (es biotina). Quindi viene ibridato con la sonda immobilizzata e rivelato con un enzima coniugato con streptavidina e un substrato, ad esempio CL, appropriato. biotin target DNA PCR CL molecule product enzyme streptavidin immobilized gene probe

32. IBRIDAZIONE IN SITU Nella tecnica di ibridazione in situ, il campione è rappresentato da un tessuto o da cellule coltivate in vitro. Questi si mettono a contatto con la sonda: si procede alla denaturazione contemporanea del DNA contenuto nel tessuto e Quello della sonda e poi si lascia avvenire l’ibridazione. DNA di Papillomavirus identificato mediante una sonda genica marcata con un tracciante fluorescente DNA rivelato mediante un intercalante fluorescente Struttura cellulare rivelata mediante un anticorpo anti-citocheratina marcato con un tracciante fluorescente