Grundlagen der mikrobiologischen Arbeitstechniken

1. Grundlagen der mikrobiologischen Arbeitstechniken VO 1

2. Studienplan • VL jeweils Mi, 1130 Uhr bis inkl. 30.6.2010 • Pflichtmodul 10: • GL der mb Arbeitstechniken • Biotechnologie • Einführung in die Systematik der MO • Vorraussetzung für: • StPlan 2008: Pflichtmodul 11 • StPlan 2003: Mikrob. GrundUE • parallel zur VL Besuch der GrundUE möglich • Zeugnis GrundUE nur mit Arbeitstechniken I • Prüfung: • Termine, am Ende der VL: 30.6.2010

3. Inhalt 1. Einführung 2. Sterilisation und Keimreduktion 3. Steriles Arbeiten 4. Kultivierung von MO‘s 5. Anreicherung und Isolierung 6. Aufbewahrung und Konservierung

4. Literatur Wallhäußer, K.H., 1995: Praxis der Sterilisation – Desinfektion – Konservierung, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, New York. Madigan, M.T., Martinko, J.M., Parker, J., 2003: Brock Mikrobiologie, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Berlin. Bast, E., 2001: Mikrobiologische Methoden, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg. Wistreich, G.A., 2003: Microbiology Laboratory – Fundamentals and Applications, Pearson Education, Upper Saddle River. Alexander, S.K., Strete, D., 2001: Mikrobiologisches Grundpraktikum, Pearson Education, München, Boston. Fuchs, G., Schlegel, H.G., 2007. Allgemeine Mikrobiologie, 8. Auflage, Thieme, Stuttgart, New York.

5. 1. Einführung • EinführungsVL, beschäftigt sich nur mit Grundlagen, die in anderen VLs vertieft werden • Labormethoden • Systematik • Biochemie • Angewandte Mibi • Physiologie • Arbeitstechniken II • usw., usw., usw.

6. 1. Einführung • Mikrobiologie ganz allgemein beschäftigt sich mit lebenden Zellen und damit, wie diese ihre Aufgabe(n) erfüllen • Eigenschaften lebender Zellen • Fähigkeit zur Reproduktion • Differenzierung • Kommunikation • Evolution

7. 1. Einführung • Grundelemente einer Zelle • Proteine • Lipide • Nukleinsäuren • Polysaccharide • Mikrobiologie beschäftigt sich mit: • Eukaryonten (Mikroalgen, Pilze, Protozoa) • Prokaryonten (Bacteria, Archaea) • Viren (als nicht selbstständig lebensfähige Teilchen ohne eigenen Stoffwechsel und eigene Reproduktionsfähigkeit)

8. 1. Einführung • Mo‘s unterscheiden sich von Pflanzen und Tieren v.a. durch • geringere Größe und geringere morphologische Differenzierung • Stoffwechselphysiologische Vielfalt • Anpassungsfähigkeit • hohe Stoffumsatzraten • hohe Synthese- und Vermehrungsraten • nahezu Allgegenwart • weltweite Verbreitung

9. 1. Einführung • Größenvergleich (ca.): • Protozoa: 1 bis 15 µm • Pilze: 10 bis 15 µm • Algen: ca. 30 µm • Bakterien: 0,2 bis 10 µm • Viren: noch eine Dimension kleiner

10. 1. Einführung • Robert Koch (*1843) • Kochsche Postulate • Pathogener MO in allen kranken Tieren vorhanden, fehlt aber in allen gensunden • Kultivierung (Agarplatte) – Reinkultur • gesundes Tier mit Reinkultur infizieren • aus infiziertem Tier kann der pathogene Organismus wieder isoliert werden (Reinkultur)

11. 1. Einführung • Grundsätzliches: • Zahlen: • dt: Komma (16,46) • engl: Punkt (16.46) • mehrstellige Zahlen nicht mehr mit Komma (falsch: z.B. 53,360.265) sondern mit Leerzeichen (richtig: z.B. 53 360 265) trennen • für große Zahlen Zehnerpotenzen verwenden: 53 360 265 wird zu: 5,34 * 107

12. 1. Einführung • Genauigkeit: • richtet sich nach der Genauigkeit der verwendeten Messmethode • Bei der Angabe von Ergebnissen sind soviel Stellen anzugeben, dass die vorletzte Stelle noch sicher, die letzte jedoch bereits als unsicher gilt. • 16,46 43,236 59,696 ergibt 59,69 • bei Rechnungen am Computer IMMER mit der exakten, niemals mit der gerundeten Zahl rechnen • Zahlen „überschlagen“

13. 1. Einführung • Genauigkeit: • Zahlen „überschlagen“: • auf einer Platten sind Bakterienkolonien zu sehen • als Rechenergebnis kommen 10-6 Zellen pro Einheit heraus :-(

20. 1. Einführung • Mol: 1 Mol einer Substanz sind 6,022 x 1023 Moleküle dieser Substanz Avogadro: Teilchenzahl N pro Stoffmenge n • Molar (M; mol/l): Mol einer Substanz in 1000ml Lösung → Masse pro Volumen • Molal (mol / 1000 g Lm): Mol einer Substanz pro 1000g eines Lösungsmittels → Masse pro Masse • Molverhältnis (mol %): Mol einer Substanz pro 100 ml eines Lösungsmittels

21. 1. Einführung • Masseprozent: weight per weight • Gramm des gelösten Stoffes in 100 g Lösung • Angabe: (w/w) • Grammprozent: weight per volume • Gramm des gelösten Stoffes in 100 ml • Angabe (w/v) • Beispiel: 10% (w/v) Glucose in A.d. • Volumsprozent: volume per volume • ml des gelösten Stoffes in 100 ml Lsg. • Angabe (v/v) • Beispiel: 10% (v/v) Acetonitril in A.d. • oder: 10% (v/v) aqu. Acetonitril

22. 1. Einführung Literatur zum Chemisch-Rechnen: • Hillbrand U., 2007, Stöchiometrie. Springer, Berlin, Heidelberg. • Wittenberg W., 2005, Rechnen in der Chemie, Grundoperationen, Stöchiometrie. 15. Auflage. Springer, Wein, New York. • Pflichtmodul I

23. 1. Einführung

24. 1. Einführung • Herstellung von 100 ml einer 50 mM KH2PO4 Lsg.: • MKH2PO4 = 136,09 g/mol • 0,68 g 100 ml-1 für eine 50 mM Lsg

25. 1. Einführung • Herstellung von 200 ml einer 1 M HCl Lsg. • MHCl = 36,5 g/mol • Konz. = 37% (w/v) • Dichte = 1,19 • 37%ige HCl ist 12,06 molar • 16,6 ml 37%ige HCl auf 200 ml

26. 1. Einführung • Herstellung von 10 ml einer 10%igen (w/v) Fleischextrakt Lsg. • 1 g FE auf 10 ml A.dest. • Herstellung von „molaren Lsgen“ (exakt) immer im Messkolben (z.B. 50 mM KH2PO4, 1 M HCl) • „%-Lsgen“ (w/v, v/v) normalerweise auch im Messkolben (ABER: Fragestellung beachten!!!)

27. 2. Sterilisation und Keimreduktion • Mo‘s sind ubiquitär • Arbeitsgeräte müssen frei von allen lebenden bzw. vermehrungsfähigen Mo‘s (steril) sein • Nährmedien müssen steril sein • Kontaminationen (Einschleppung von unerwünschten Mo‘s) müssen ferngehalten werden = steriles Arbeiten

28. 2. Sterilisation und Keimreduktion • Def. steril bzw. keimfrei: • Def.: • frei von vermehrungsfreien Mo‘s • frei von Ruhestadien und Dauerformen (z. B. Sporen) • Def. Sterilisation: • Beseitigung und/oder Abtötung aller Mo‘s • Inaktivierung von Viren • die abgetöteten Keime verbleiben im Medium • Def. Desinfektion: • selektive Abtötung bzw. irreversible Inaktivierung aller krankheitserregender Keime an und in kontaminierten Objekten • steril/ teilweise steril/ unsteril

29. 2. Sterilisation und Keimreduktion 2.1. Abtötung durch feuchte Hitze • beruht v.a. auf der Denaturierung von Proteinen (Zellproteinen) • bei trockener Hitze auf der Oxidation intrazellulärer Bestandteile • Mo‘s verschieden anfällig für beide Varianten • Wirkung abhängig von: • Art des Mo‘s • Alter • Zustand (vegetative Zelle oder Spore) • Umwelt- bzw. Milieubedingungen (Nährstoffe, pH,…) • Ausgangskeimzahl • ABER NICHT von: Form der Mo, Größe, NS, …

30. 2. Sterilisation und Keimreduktion 2.1. Abtötung durch feuchte Hitze • Wirkungsgradevaluation durch D-Wert Bestimmung • Def. D-Wert (dezimale Reduktionszeit) : • Zeit, die erforderlich ist, um unter genau festgelegten Bedingungen die Ausgangskeimzahl um eine Zehnerpotenz (d.h. um 90%) zu reduzieren. • vegetative Zellen werden durch Hitze relativ leicht abgetötet • Endosporenbildner (Bacillus, Clostridium) hitzeresistent • Bei der Arbeit mit gemischten Populationen muss immer von den resistentesten Formen ausgegangen werden

31. 2. Sterilisation und Keimreduktion 2.1. Abtötung durch feuchte Hitze 2.1.1. Dampfsterilisation (Autoklavieren) • Autoklavieren • sicherste Sterilisationsmethode • Einwirkung von gespanntem, gesättigtem Wasserdampf • Normalerweise 121 °C, 2 bar Dampfdruck • Angaben für die notwendige Autoklavierzeit schwanken zwischen 10 bis 15 min, 15 min, und 20 min • Autoklavierzeit vom Medium abhängig (Empfindlichkeit), wenn möglich immer 20 min • ergo: Mindestautoklavierzeit 20 min • Häufig Medientemperatursteuerung • Aufheiz- und Abkühlzeiten beachten (tw. bis 1 – 1,5 Stunden) • Autoklaven-abhängig: verschiedene Programme: „Müll“, Flüssigkeiten, Geräte

32. 2. Sterilisation und Keimreduktion 2.1. Abtötung durch feuchte Hitze

33. 2. Sterilisation und Keimreduktion 2.1. Abtötung durch feuchte Hitze

34. 2. Sterilisation und Keimreduktion 2.1. Abtötung durch feuchte Hitze • Autoklaventypen: • Vertikalautoklaven (Standgeräte) mit 60 bis 200 l • Topfautoklaven 10 bis 40 l • Horizontalautoklaven 10 bis 1000 l • Verlauf der Dampfsterilisation: • Aufheizzeit • Steigzeit • Ausgleichzeit (Temperaturfühler in Referenzgefäß) • Sterilisierzeit (i.d.R. 20 min) • Abkühlzeit

35. 2. Sterilisation und Keimreduktion 2.1. Abtötung durch feuchte Hitze • Kontrolle der Dampfsterilisation • chemische Indikatoren: funktionieren meist über Thermoindikatoren, die man auf das Sterilgut aufklebt; mittels Verfärbung kann man das Einwirken einer bestimmten Temp. ablesen (nicht aber die EW Zeit) • Bioindikatoren: meist Sporenstreifen in Ampullen, die an der kältesten Stelle im Autoklaven (hinten unten) angebracht werden und nach der Sterilisation in eine Nährlsg. unter sterilen Bedingungen überführt werden.

36. 2. Sterilisation und Keimreduktion 2.1. Abtötung durch feuchte Hitze 2.1.2. Tyndallisieren • fraktionierte Sterilisation genannt • mehrfaches (3x) Erhitzen auf 80 bis 100 °C meist im Wassertopf – Aufbewahrung bei Raumtemp. – Auskeimen von Endosporen – erneutes Erhitzen • umständlich, zeitraubend • zweifelhafter Erfolg

37. 2. Sterilisation und Keimreduktion 2.1. Abtötung durch feuchte Hitze 2.1.3. Kochen, strömender Dampf • zur Teilentkeimung (Desinfektionsverfahren) • Einwirkung von 100 °C • z.B. 5 minütiges Kochen von Gerätschaften • z.B. 30 minütiges Kochen von NL: es werden nur vegetative Zellen abgetötet, keine Endosporen • beispielsweise für die Herstellung von Kulturmedien für Anaerobier verwendet

38. 2. Sterilisation und Keimreduktion 2.2. Abtötung durch trockene Hitze • trockene Luft ist ein schlechter Hitzeleiter • Nachteile: • bei trockener Hitze sind deutlich längere Einwirkzeiten und höhere Temperaturen notwendig • nur begrenzt einsetzbar: nicht für Flüssigkeiten • Vorteile: • einfach • unaufwändig • keine nachträgliche Trocknung notwendig

39. 2. Sterilisation und Keimreduktion 2.2. Abtötung durch trockene Hitze 2.2.1. Heißluftsterilisation • Temp./Zeit: • 160 °C 180 min • 170 °C 120 min • 180 °C 30 min • Einpacken in Alufolie • geeignet für: • Geräte aus Metall • Glaswaren • Gegenstände, die keine Feuchtigkeit vertragen

40. 2. Sterilisation und Keimreduktion 2.2. Abtötung durch trockene Hitze

41. 2. Sterilisation und Keimreduktion 2.2. Abtötung durch trockene Hitze • Kontrolle: • durch chemische Indikatoren (Thermoindikatoren) • durch Bioindikatoren • als Teststreifen oder Indikatorbänder