KLİNİK MİKROBİYOLOJİK TANI I

1. KLİNİK MİKROBİYOLOJİK TANI I Prof. Dr. Nuri KİRAZ

2. Bakterilerin tanımlanması ve çeşitli özelliklerinin belirlenmesi sırasında bazı özelliklerinden faydalanılmaktadır. Bunlar: • 1 – Yapısal özellikleri: Şekil, boyut, hareket, boyanma özellikleri,... • 2 – Biyokimyasal özellikleri: Enzimler, besiyeri • 3 – Fizyolojik özellikleri : Oksijene gereksinimi, ısı etkisi,... • 4 – Genetik dizinin özellikleri: DNA, RNA dizi karşılaştırmaları. Günümüzde en çok kullanılan ve bir çok bakterinin yeniden sınıflanmasını ve isimlendirilmesini sağlayan bu yöntemler olmuştur.

3. MİKROSKOP:Çıplak gözle görülemeyen yapıların ve mikroorganizmaların incelenmesinde kullanılan aletlerdir. • İlk olarak 1683 yılında Antony Van Leeuwenhoek • Temel olarak bütün mikroskoplarda aynı yapılar bulunmaktadır: • a) Işık kaynağı • b) Kaynaktan gelen ışınları demet halinde toplayan ve ışık şiddetini denetleyen diafragma • c) Gelen ışığı kırarak incelenen cisme toplayan kondansatör • d) Cismin görüntüsünü büyüterek göze ulaştıran mercekler ( Göze yakın OKÜLER, örneğe yakın olanlar OBJEKTİF)

4. Mikroskobun büyütme gücü objektif ve oküler büyültme miktarlarının çarpımı ile belirlenir. 100 büyültmeli bir objektifle bakılıyor ve okülerin büyültme gücü 15 ise o mikroorganizma 100x15:1500 kez büyültülmüş demektir. Genel bir kural olarak boyanmış örnekler immersiyon objektifi ile immersiyon yağı damlatılarak incelenirler. Boyasız lam-lamel arası örnekler ise kuru sistem denilen 10’luk ya da 40’lık objektiflerle incelenirler.

5. Amaç hareket incelemesi ise çukur lamda asılı damla ile inceleme daha iyi sonuç vermektedir. Burada mikroplu sıvı lamele konur ve lamel üzerine çukur lamın kapatılması sonrasında üste getirilerek kuru sistem objektiflerinde incelenir. Hareket özellikleri faz-kontrast mikroskoplarda da iyi gözlenir. • Mikrobiylojik tanımlamada ışık mikroskobu haricinde farklı özellikleri blunan diğer mikroskoplardan da faydalanılır.

6. Faz-kontrast mikroskobu: Işık mikroskobu kadar büyütürken sıvı ortamda yapıların şekil ve hareketlerini belirgin hale getirir. Özellikle hareketlerin izlenmesinde faydalıdır. Farklı yoğunluklarda farklı fazlar oluşumunu belirgin olarak gösteren bir optik sistemden oluşur • Karanlık alan mikroskobu: Işık mikroskobundan farklı olarak kondansatörden geçen ışınların örnekte kırılarak göze ulaşmasını sağlar. İleri düzeyde bir kontrast farkı oluşur ve böylece normalde görülemeyecek kadar ince yapıların (Örneğin spiroketlerin ) kolayca görülmesini sağlar

7. Elektron mikroskobu: Viruslar gibi küçük mikroorganizmaları ve hücrelerin iç yapılarını belirleyebilmek amacıyla geliştirilmiş özel mikroskoplardır. Bu mikroskoplar > 100 000 büyütme gücüne sahiptir. Ayırt etme sınırı 0.5 nanometre kadar küçüktür. • Floresans mikroskobu: Florokrom denilen bazı maddelerin aldıkları ışığı daha farklı bir dalga boyuna dönüştürerek yansıtmaları kullanılarak geliştirilmiş mikroskoplardır. Özel florokrom boyalarla boyanan yapılar floresans mikroskobunda incelenebilir. Auramin M. tuberculosis’i, Calcofluor beyazı mantarları, Acridin turuncusu canlı bakterileri boyayarak görünür hale getirir. Bu mikroskoplarda ışık örneğe üst kısımdan verilmekte ve örnekteki floresans araştırılmaktadır

8. Mikropların mikroskopta incelenmesi • Kuru ortamda mikropları incelemek için sıvı ortamda ince bir örnek lama sürülerek havada kuruması beklenir. Sonra genelde boyama yöntemleri kullanılarak inceleme yapılır. Boyama öncesinde mikroplar önce tesbit edilmelidir. Tesbit; morfolojik özelliklerinin mümkün olduğunca korunarak mikroorganizmaların lama yapışmasını sağlamakdır. Örnekler alevden üç kez geçirilerek ya da kimyasal maddeler ile (metanol, etanol,alkol-eter,...) tesbit edilebilir.

9. Mikropların mikroskopta incelenmesi-2 • Çeşitli boyalar kullanılarak mikroplar boyanabilir. • Negatif boyama: Kapsüllü bazı yapıları ortaya çıkarmakta kullanılabilir. Tüm ortam boyanırken kapsülü olan mikroplar boyanmadan kalırlar. Bu boyama yöntemi için genelde çini mürekkebi kullanılır. • Pozitif boyamada ise boya mikroplar tarafından tutulur ve ortamdan farklı bir renk alırlar.

10. Mikropların mikroskopta incelenmesi-3 • Basit boyama tek bir boyayla yapılır ve bu boyamaya en iyi örnek metilen mavisidir. Havada kuruyan ve tesbit edilen preparat üzeri metilen mavisi ile kaplanır ve iki dakika sonra boya dökülüp yıkanarak incelenir. Burada tüm yapılar mavi olarak görünür. • Birleşik boyama birkaç bazik boyanın peşpeşe ya da birarada kullanıldığı boyama yöntemidir(Gram, EZN yöntemi).

11. Mikropların mikroskopta incelenmesi-4 • GRAMyönteminde temel mekanizma hücre duvar yapısındaki farklılıktan kaynaklanmaktadır. Bu farklılığın kesin nedeni bilinmemekle birlikte duvar yapılarının kalınlığı, lipopolisakkarid yapılarla ilgili olabileceği düşünülmüştür. Bakterilerin hücre duvar yapıları karşılaştırıldığında bazı temel farklılıklar belirlenmiştir. Bu farklılıklar:

13. Mikropların mikroskopta incelenmesi-5 • Bakteriler hücre duvar yapılarındaki özelliklere göre çeşitli bölümlerde incelenmektedir: • 1 – Firmicutes bölümü: Kalın, Gram (+) hücre duvarına sahip olanlar. • 2 – Gracilicutes bölümü: İnce, Gram(-) hücre duvarı • 3 – Tenericutes bölümü: Yumuşak, hücre duvarı olmayan bakteriler (Mollicutes sınıfı) • 4 – Mendosicutes bölümü: Hücre duvarı kusurlu ve muramik asit içermez.

14. Mikropların mikroskopta incelenmesi-6 • Bazı bakteriler ise uygunsuz koşullarda hücre duvarlarını kaybederek yaşamlarını sürdürebilirler; buna bakterilerin L- formu denilmektedir. Bu bakteriler duvarla ilgili fonksiyonları nı ve boyanma özelliklerini kaybederler. • Bakteriler hücre duvar yapılarındaki farklılıklardan başka morfolojik özellikleriyle de ayrılmaktadırlar. Yuvarlak şekillere kok boyu eninden uzun olanlara çomak adı verilir. Boyu enine eşit görünen çomaklar için kokobasiltanımı kullanılır.

15. Mikropların mikroskopta incelenmesi-7 • Uzun zincirler yapmış koklara streptokok, kümeler yapmış koklara stafilokok, dörtlü yapılaratetrad, balya şeklinde biraraya gelenlere sarsin adı verilir. Yanyana duran iki kok diplokok adını alır. Bu yapılar özel görünümlerde bulunabilirler ve tanımlamada önem taşırlar.(Mum alevi gibi diplokok: pnömokok, kahve tanesi gibi: gonokok,..vb) • Bazı çomaklar uzayıp dallanmalar gösterebilirler. Bazı bakteriler(spiroketler) ise kıvrımlara sahip olabilir.

16. MİKROBİYOLOJİ LABORATUVARINA UYGUN ÖRNEK GÖNDERİLMESİ • Klinik Mikrobiyoloji laboratuvarlarının her zaman en önemli sorunu klinik ile yeterli iletişimi sağlayamamaktır. İdeal olan, klinik bulgular ve beklentilerin laboratuvara en uygun biçimde aktarılmasıdır. Genel olarak laboratuvar için gerekli bilgiler tabloda belirtilmektedir.

17. MİKROBİYOLOJİ LABORATUVARINA UYGUN ÖRNEK GÖNDERİLMESİ-2 • Örneklerin gönderilmesi konusunda bir diğer önemli nokta zamandır. Unutulmaması gereken şey mikrobiyoloji laboratuvarında; enzim, kimyasallar, reaksiyonlar,… değil, doğrudan “yaşam” ölçülmektedir. • Geciken örnekte ya çok sayıda bakteri üreyecek ve yanlış sonuçlara yol açacak ya da etken ölecek ve deneyden sonuç alınamayacaktır. Eğer gecikme olacaksa uygun sıcaklıklarda veya taşıyıcı besiyerlerinde saklanmalıdır.

18. MİKROBİYOLOJİ LABORATUVARINA UYGUN ÖRNEK GÖNDERİLMESİ-2 • Örneklerin gönderilmesi konusunda bazı temel ilkeler şöyle özetlenebilir: • Tüm örneklere bulaşıcı enfeksiyon etkenleri içeriyor gibi davranılmalıdır. • Hastaları örnek alma konusunda bilgilendirmek uygun ve kaliteli örnek elde etmek yönünden oldukça başarılı sonuçlar vermektedir. • Mikrobiyolojik inceleme özellikle bakteri kültürü için ,örnekler antibiyotik tedavisinden önce alınmalıdır. Eğer mümkün değilse laboratuvar kullanılan antibiyotikler konusunda bilgilendirilmelidir

19. MİKROBİYOLOJİ LABORATUVARINA UYGUN ÖRNEK GÖNDERİLMESİ-2 • Yeni bir test uygulanacaksa ya da rutin dışı bir etken aranacaksa laboratuvardan bilgi alınması esastır. Özel etkenler; özel besiyerleri, özel örnekler ve özel taşıma şartları gerektirir. • Flora olan bölgelerden kültür alınırken flora ile temas etmemek, sadece lezyon bölgesinden örnek almak önemlidir. Floralı bölgelerden anerop örnek almak uygun değildir. • Foley sonda ucu, kusma örneği, kolostomi içeriği gibi örneklerin kültürü yapılması önerilmez. Gastrik aspirat da sadece tüberküloz için kullanılabilir.

20. MİKROBİYOLOJİ LABORATUVARINA UYGUN ÖRNEK GÖNDERİLMESİ-2 • Üzerinde etiket ve kimlik bilgileri olmayan örnekler, bulaşmış ya da delinmiş kaplarla gelen örnekler de çalışılmaz. Steril kaplarda gelmeyen örneklerden de çalışma yapılmaması önerilir. • Enjektör ile örneklerin gönderilmesi kesici-delici alet yaralanma riski nedeniyle önerilmez, özel taşıyıcı sistemler önerilir.Bu sistemler kulanılamadığında ise en azından iğnenin ucu açık olarak ya da bükülerek örnek gönderilmemelidir. • Sinüzit için burun sürüntüsü, otitis media için kulak sürüntüsü uygun örnek değildir, anlamlı sonuç vermez. • Tabloda en çok gönderilen örnekler ve dikkat edilmesi gereken noktalar özetlenmiştir:

24. KAYNAKLAR • Aygün G. Klinik mikrobiyoloji laboratuarında klinik ve laboratuar iletişiminin önemi. Klinik Gelişim Dergisi 2007; 20(4): 48-52. • Dune WM, Pinckard JK, Hooper LV. Clinical microbiology in the year 2025. J Clin Microbiol 2002; 40: 3889-3893. • Forbes BA, Sahm DF, Weissfeld AS. Diagnostic Microbiology. Mosby Elsevier, 12.th eds, St Louis, 2007. • Isenberg HD. Clinical Microbiology Procedures Handbook. ASM Pres, 2.th eds Washington D.C. 2004. • Miller JM. A guide to specimen management in clinical microbiology. ASM Pres, Washington D.C., 1999. • Öztürk R. İnfeksiyon Hastalıklarında Laboratuar Tanı. Klinik Gelişim Dergisi 2007; 20 (4): 19-35. • Rappuoli R. From Pasteur to genomics: progress and challenges in infectious diseases. Natur Medicine 2004; 10: 1177-1185. • Unat EK. Temel Mikrobiyoloji. 3.Baskı, İÜ Cerrahpaşa Tıp Fakültesi Yayını, İstanbul, 1997: 461-497.