lezione 23-24 venerdì 11 Dicembre 2009

1. lezione 23-24 venerdì 11 Dicembre 2009 corso di genomica a.a. 2009/10 aula 6a ore 14.00-16.00 corso di laurea specialistica magistrale Biotecnologia lezione 15 Dicembre Programmi informatici per confronti genomici. Dr.P. D’addabbo

2. verso l’epigenetica metodi di analisi genomica cercare sul genoma le funzioni cercare i meccanismi che attivano le funzioni cercare le strutture che attivano i meccanismi per esprimere le diverse funzioni cercare come variano le strutture che attivano i meccanismi per esprimere le diverse funzioni regolazione è una definizione troppo generica? chi è che regola i regolatori? il sistema è ciclico

3. dagli enhancers alle Regulatory Regions complessi regolativi = strutture che contengono più enhancers ma anche gli insulators e modulators (inibitori) effetto sinergico : più facile da stabilire perchè funziona su geni reporter anche su cellule in vitro abbiamo visto che le RR o enhancer complex possono distare fino a megabasi dai geni che controllano come si possono studiare? come sono regolate?

4. regolazione dei regolatori regolazione trans e regolazione cis il terzo livello è quello della regolazione epigenetica ma anche questa può essere cis regolata e trans regolata la regolazione cis funziona tramite regioni di DNA a cui si legano complessi proteici e permettono il rimodellamento della cromatina con l’avvicinamento del complesso al promotore la regolazione trans funziona tramite proteine che interagiscono ad uno dei tanti possibili livelli direttamente o indirettamente

5. il livello epigenetico il livello epigenetico è quello che precede la fase in cui si attivano le regioni regolative però essendo anch’esso un sistema a base enzimatica funziona con una regolazione analoga alle altre, ma che produce effetti sulla cromatina e sul suo funzionamento come già abbiamo detto in un sistema circolare in cui la cellula riceve stimoli dall’esterno e li trasmette all’interno e viceversa - difficile definire quale sia il livello superiore - sicuramente esiste un presente ed un poi - si tratta di vedere quele è il punto presente e da quello discendono gli altri ma solo temporalmente

6. una Regione Regolativa deve avere dei confini “boundaries” “insulators” (CTCF) e poi ha le regioni interne con gli enhancers (DNAse I) al momento attuale si conoscono gli enhancers con i siti di consensus per i fattori di trascrizione esistono altre informazioni sui siti di metilazione (epigenetici) si potrebbero individuare i siti di binding o di avvolgimento ai nucleosomi

7. dal DNAse assay per individuare una regione con possibile attività di enhancer si incomincia a fare i test di sensibilità alla DNAse I si stabilisce un pattern della regione : una mappa

8. strategia DNAse I assay

9. throughput analysis of DNAse Historically, the simplest method to robustly identify active gene regulatory elements has been enzymatic digestion of nuclear DNA by nucleases such as DNaseI. Regions of extreme chromatin accessibility to DNaseI, commonly known as DNaseI hypersensitive sites, have been repeatedly shown to be markers for all types of active cis-acting regulatory elements, including promoters, enhancers, silencers, insulators, and locus control regions. However, the original classical method, which for over 25 years relied on Southern blot, was limited to studying only small regions of the genome. Here we describe the detailed protocol for DNase-chip, a high-throughput method that allows for a targeted or genome-wide identification of cis-acting gene regulatory elements. Methods Mol Biol. 2009;556:177-90. Mapping regulatory elements by DNaseI hypersensitivity chip (DNase-Chip). Shibata Y, Crawford GE.

10. le RR inserite in un contesto il contesto in cui stanno inserite è tutto da scoprire è tanto se si sa che svolgono il ruolo di regione regolativa il meccanismo di azione si comprende tramite analisi 3D la tridimensionalità dinamica spazio/temporale metodi ChIP e fluorescenza microscopi confocali un esempio : la 3’RR delle IgH

11. la regolazione delle immunoglobuline contemporaneità della maturazione del linfocita B e delle immunoglobuline le immunoglobuline sono costituite da una catena pesante ed una leggera e la produzione deve essere coordinata la produzione è regolata nelle cellule della memoria dopo lo switch isotipico e poi riattivata quando sono stimolate all’esterno i linfociti B partecipano con i T e tutti gli altri alla risposta immunitaria umorale / cellulo mediata quindi la regolazione deve tenere conto di tutte queste interazioni

12. la struttura della RR della catena pesante studiata nel topo e ritrovata nell’uomo e in tutti i mammiferi è altamente conservata i meccanismi della sincronizzazione non sono ancora noti è supposto che la soluzione stia nella compartimentazione nucleare ritorna l’ipotesi dell’

13. mappe dei loci IgH e IgL U LOCI DELLE CATENE PESANTI E LEGGERE DELL’Ig Locus catena leggera l TOR VERGATA Cromosoma 22 Locus catena leggera k Cromosoma 2 Locus catena pesante Cromosoma 14 attivazione selettiva e coordinata dei fenomeni maturativi (i siti di attacco alla matrice nucleare, colocalizzazione ?)

14. cluster Ig topo-uomo (duplicazione) TOR VERGATA Mouse Igh cluster Chromosome 12 mta1 trascrizione JDV 12F1 Human Igh cluster Chromosome 14 mta1 JDV 14q32.33 centromero telomero mta1 crip2 crip1 hole a e g2a g2b g1 g3 d m J D V Em hs 1,2 hs 3A hs 4 hs 3B (cloni instabili) BAC199M11(AF450245) mta1 crip2 crip1 hole a2 e g4 g2 g a1 e g1 g3 d m J D V Em hs 1,2 hs 3 hs 1,2 hs 3 hs 4 hs 4 3’a2 3’a1 IgH3’RR-1 g hs4 hs1.2 hs3 20bp a1 elk 2.1 3’a1 86,035,000 86,040,000 86,045,000 86,050,000 86,055,000 86,060,000 86,065,000 86,070,000 86,075,000 IgH3’RR-2 hole elk 2.2 hs4 hs1.2 hs3 a2 20bp 3’a2 85,894,500 85,904,500 85,914,500 85,924,500 85,934,500 85,944,500 85,954,500

15. IgH3’RR-1 TOR VERGATA SA2.5 A2R Poly A site END OF HOMOLOGY WITH ALFA2 H* H B E B B B H B H H U 14 U9 1 R4 R6 Ua1 U3 U5 R3 R3r U5r Ua4 R5 Alu LTR ELK2 U1 R1 R2 U4 U6 U7 U8 U6r Ua2 Ua3 R5 U11 U12 U16 U13 K10 retrovirus U15 Ua5 U10 U2 A HS3 HS1,2 HS4 clone CHR77 (35.616 kb) Chromosome 14  4  2 1  1 2 3 centromero   IgH3’RR-2 B SF AL928742 (40 kb) Poly A site END OF HOMOLOGY WITH ALFA1 H H B B H B E B B H U9 Ub4 R6 Alu LTR 2 R1 U6r R4 Ub3 R5 Ub1 Ub2 R3 U 8r U5 U4-5 U 3 U13 U14 U15 U16 U2 U4 U7 U10 U11 U12 R3r R5 U1 U7r U5r R3 U6 HS3 HS1,2 HS4 SA2.5 A2R A2F

16. TOR VERGATA   LCR locus control region (nel topo 4 enhancers)IgH3’RR-1/-2 (nell’uomo 3 enhancers/locus) LCR *HS = hyper sensitivity to DNase I *HS3A HS1,2 HS3B HS4 +5,6,7 mouse Ig heavy locus V D J a   b   L C R E transcription human chromosome 14 q 32 HS3B HS1,2B HS4B HS3A HS1,2A HS4A 3’RR-1 3’RR-2 E   3 1  1 2 4  a2  centromero duplicazione 1 duplicazione 2

17. cosa ci dicono i confronti genomici • confronti nelle specie delle varie strutture conservate • analisi della conservazione e variazione interspecifica • analisi della variabilità intraspecifica (polimorfismi) • individuazione delle regioni rilevanti • metodi di analisi dei confronti genomici (lezione 15 Dic) • ipotesi sui meccanismi

18. quali studi sono stati fatti sulle 3’RR IgH gli enhancers funzionano come un complesso? il sistema è ridondante e le funzioni possono sopperire e sostituirsi alle altre per mantenere il sistema funzionante per questo ci possono essere risultati discordanti tramite la disattivazione o delezione di parti del complesso a volte dei topi transgenici per la mancanza di un enhancer non hanno dato fenotipo

19. synergism of HS3A-B-HS1,2-HS4 TOR VERGATA Symergic effects HS fragments are able to synergize with Vk,VH,IgH germline promoters (g2b, g3, a,e) and non Ig-prmoters (c-myc) so as to enhance the transcription activity in a tissue and stage specific manner. (Ong et al, 1998)

20. perchè due 3’RR ? sono ridondanti ? U TOR VERGATA se nell’uomo ci sono due 3’RR ci sarà un motivo ? 3 domande + 1: è cambiato il sistema di regolazione rispetto al topo ? nell’uomo si possono studiare i polimorfismi (i topi di campagna si allevano male) - dalle diverse forme alleliche si può capire il funzionamento delle due 3’RR ? - hanno tempi di attivazione diversi? - si attivano e disattivano in fasi diverse della vita del linfocita B?