La croissance des cellules in vitro

1. La croissance des cellules in vitro En quoi les hormones végétales sont-elles intéressantes dans la culture in vitro ? Travaux Personnels Encadrés : Pauline Lemoine, Justine Petiot, Oriane Joubert

2. I/Un peu d’histoire…

3. Le chercheur WENT, en 1928, avait d'abord mis au point le " test Avena " pour détecter les substances de croissances (alors inderterminées). Un coléoptile d'avoine, d'une variété fixée, décapité avant d'avoir atteint sa taille définitive, recevait sur une partie de son extrémité un petit bloc de gélose renfermant la substance à étudier. Si cette substance était active, elle se diffusait de haut en bas. La région située sous le bloc de gélose s'allongeait alors plus que l'autre, et il en résultait une courbure du coléoptile. Plus cette courbure (tropisme) était marquée, plus la substance était active. • C’est à partir de cette découverte que la culture in vitro pris une place importante dans le monde scientifique.

4. Certaines cellules végétales ont la capacité de régénérer la plante entière. Cette propriété, qui s'exprime dans la multiplication végétative naturelle, est connue et utilisée depuis longtemps, avec le bouturage par exemple. 1902. Découverte de la totipotence des cellules végétales par Haberland. Un tissu végétal est capable de régénérer une plante 1950. Premières techniques de culture in vitro. Il s'agit de la technique de multiplication végétative, développée par Morel et Martin, sur la pomme de terre.

5. Quelques moments clés ! • Régénération de plantes entières et multiplication végétativeL’auxine a été mise en évidence dans les années 1930. En 1950, une étape majeure scientifique a été découverte : la découverte de l’existence et des propriétés d’autres hormones de croissance végétales qui contrôlent la formation de racines (c’est la rhizogenèse) et le développement des parties aériennes de la plante. Ces hormones, qui sont indispensables à la croissance de la plante, doivent être fournies aux cellules en culture. De plus, on a déterminé que la culture in vitro nécessitait une certaine hygiène pour son bon déroulement: c’est l’asepsie. • Guérison des plantes par culture de méristèmesLa première application de ces découvertesdate des années 1950. Il a été montré que même lorsque la plante est atteinte par un virus ou une bactérie, les méristèmes eux sont indemnes. D ’où l ’idée de régénérer une plante à partir des méristèmes. Ces travaux ont été mené par l ’INRA (Institut National de la Recherche Agronomique). En 1952, ils ont abouti à la guérison d ’une plante: le dahlia. Cette technique a permis de sauver de nombreuses espèces ou variétés atteintes de viroses graves (infection par un virus).

6. Multiplication végétativeCe n ’est que dans les années 60 et 70 que fut exploité le potentiel de multiplication de la culture in vitro. A partir d ’un seul bourgeon, on peut obtenir plusieurs millions de nouvelles plantes en un an. La mise en œuvre de ce mode de multiplication nécessitetoutefois, pour chaque nouvelle espèce ou variété, l’élaboration de milieux de culture particuliers et certaines plantes restent en fait très difficiles à cultiver in vitro.

7. II/Les hormones végétales

8. Hormones et régulateurs de la croissance végétale se regroupent en familles. Les éléments les plus représentatifs sont l’auxine et les cytokinines. Les hormones végétales, ou phytohormones, commandent le programme de croissance des cellules végétales. Deux faits valident cette affirmation : - les réactions des plantes aux changements de l'environnement (déclenchées par les hormones - les réactions, observées in vitro, des cellules végétales à différents phytohormones. Les cellules des plantes ont la capacité de régénérer un organisme complet. Par conséquent, on sait que l'apport d'hormones en quantités appropriées dans un milieu où croissent des cellules plus ou moins différenciées déclenche laformation d'organe. Ainsi, selon la proportion d'auxine et de cytokinine, les cellules donnent naissance à des tiges, à des racines ou à des tissus indifférenciés.

9. Une action optimale selon la Concentration en auxine et cytokinine

10. Comme nous avons vu précédemment, les hormones de croissance ont des actions différentes pour des concentrations différentes. Ainsi les auxines contrôlent la croissance des cellules en stimulant l'augmentation de taille des cellules. La croissance des cellules est effectuée pour des concentrations d'auxine de l'ordre de 10-7 à 10-5 g.mL-1. Cela provoque généralement la formation de racines latérales et de tissus conducteurs. Enfin, les cytokinines contrôlent la division cellulaire. Pour des concentrations précises, elles permettent la formation de bourgeons et de rameaux. Représentation, d'après K.-V. Thimann, de l'influence de la concentration des tissus en AIA sur leur développement, selon la nature des parties des plantes.

11. Quel est le rôle chimique des hormones de croissance ?

12. Les hormones végétales sont des messagers chimiques que les cellules utilisent pour moduler leur développement à un environnement auquel les plantes, immobiles, ne peuvent échapper. Par définition, une hormone est une substance qui, libérée dans un organisme, modifie l'activité des autres cellules qui lui sont spécifiquement sensibles. Ainsi, il existe des récepteurs spécifiques à chaque hormone. Ils sont placés sur des cellules cibles et permettent la liaison entre l’hormone et la cellule. Mais avant cela, des précurseurs tels que le tryptophane pour l’auxine ou l’adénosine pour les cytokinines, permettent la synthèse de chaque hormone. Les cellules utilisent les hormones végétales pour moduler leur développement à leur environnement…

13. L’AUXINE Un facteur de croissance

14. L’auxine (ou acide indole-3-acétique) est une hormone végétale contrôlant la croissance des cellules ; c’est un facteur de croissance. Elle agit à faible concentration (10-7 à 10-5 g.mL-1). Se fixant sur des cellules cibles. Elle provoque la formation de racines latérales et de tissus conducteurs.

15. L’auxine est fabriquée dans l’apex des tiges, dans les méristèmes et les jeunes feuilles des bourgeons terminaux à partir d’un acide aminé, le tryptophane. Une fois fabriquée, l’hormone migre vers ses cellules cibles. Ce transport s’effectue des apex vers la base, on dit que le transport de l’auxine est polarisé. Apex : les cellules synthétisent l’auxine (à l’aide de précurseurs comme le tryptophane) Transport de l’auxine Effet biologique : croissance

16. Effet du pH de l’auxine sur l’élongation cellulaire Des expériences ont montré qu’une acidification du milieu extra-cellulaire stimule l’élongation des cellules et la plasticité de la paroi. Or l’auxine est une hormone de nature chimique acide ( acide indole-3-acétique ). Ainsi, la baisse de pH dans la paroi de la cellule est due à l’activité de la membrane plasmique qui expulse les protons du cytoplasme vers la paroi. é l o n g a t i o n ( mm ) pH4.5 Flux de protons donc acidification de la paroi sous l’effet de l’auxine 15 pH6.5 H+ 10 H+ H+ Relâchement du réseau moléculaire pH 4.5 H+ 5 Milieu intra-cellulaire pH 6.5 Membrane plasmique Milieu extra-cellulaire 0 30 60 Temps ( min )

17. L’influencede la lumière sur l’auxine • Le coléoptile d’un graminée (blé…) penche lorsqu ’il est éclairé latéralement, c’est ce qu’on appelle le tropisme des plantes. Cette courbure est le résultat d ’une croissance différente entre le côté éclairé et le côté qui n ’a pas accès à la lumière. • La lumièremodifie la répartition de l ’auxine dans la plante et permet ainsi une croissance orientée de la plante. Sous de forts éclairements l’auxine est détruite par la lumière. Mais pour des éclairements plus faibles la lumière provoque la migration de l’auxine dans la partie non éclairée de la plante. C’est pour cela que la face sombre s’allonge plus que la face éclairée. La tulipe penche du côté éclairé par le soleil

18. En conclusion : une double action sur la croissance cellulaire - Une action à plus long terme sur l’expression de gènes codant pour des protéines intervenant spécifiquement dans l’élongation cellulaire : l’auxine stimule la synthèse d’ARN spécifique.Ces ARN sont ensuite traduits en protéines enzymatiques nécessaires à la fabrication des composants de la paroi (d’où l’élongation cellulaire). - Une action a court terme sur la plasticité de la paroi : l’auxine abaisse le pH de la paroi et cette diminution provoque le relâchement pariétal (de la paroi).

19. Modèle simplifié de l’action de l’auxine sur la cellule en croissance AUXINE Paroi cellulosique plasticité élongation récepteur Membrane plasmique Effets de l’auxine dans la cellule H+ turgescence transcription protéine cytoplasme noyau vacuole

20. Une hormone végétale: la Cytokinine

21. C ’est une famille d ’hormones découverte par Skoog , quand il remarqua des résultats aberrants ou non cohérents dans l ’étude des auxines. Il appela cette nouvelle forme d ’hormones les kinétines, puis cytokinines. Les cytokinines sont des hormones synthétisées par la racine. Lorsque l’on injecte de la cytokinine à la base d ’une tige, on remarque que cette dernière migre vers le bourgeon où elle se concentre. Elle favorise le débourrage des bourgeons axillaires. La cytokinine contrôle le développement des feuilles. La cytokinine

22. La cytokinine est un dérivé de base azotée se trouvant dans les acides nucléiques. Elle stimule la synthèse de l ’ADN, qui est nécessaire au déroulement de la mitose, ainsi que la synthèse de différentes protéines nécessaires à la prolifération cellulaire. Pour repérer les lieux forts de concentrations il faut injecter une cytokinine radioactive. La croissance se met en route dans les bourgeons axillaires inhibés sur le témoin 48 heures après. On remarque ici l’élément azote. Cet élément montre bien que la cytokinine est un dérivé de base azotée. La cytokinine que nous avons utilisé est sous cette forme : la cytokinine Benzyladenine

23. IV/ Les différentes étapes de la mise en place de cultures in vitro

24. L'installation • C'est la phase qui consiste à désinfecter les boutures (racine, bourgeon, etc.) ou les graines afin de les rendre stériles, avant de les placer sur un milieu de culture approprié. • Il existe une multitude de milieux de culture. Ceux-ci doivent fournir à la plante tous les éléments nutritifs dont elle a besoin. On distingue deux types de milieux, ceux ayant une consistance liquide et servant aux cultures de cellules, et ceux 'solides', ayant la consistance d'un flan, servant aux cultures de tissus, bourgeons, racines ou cals.

25. Nous avons utilisé des milieux solides

26. La mise en culture En horticulture, on prélève un groupe de bourgeons (une tige), on le met à raciner (bouture, marcottage), on le laisse grandir, et on peut reprendre un autre groupe de bourgeons et ainsi de suite.Avec les cultures en laboratoire, et grâce aux hormones, il est théoriquement possible de multiplier une plante à partir d'une seule cellule. Le choix des hormones et de leurs concentrations doit être optimisé pour chaque espèce afin que cette théorie soit réalisable. Beaucoup de plantes ne sont que peu étudiées, surtout parce qu'elles n'ont pas ou peu de valeur économique.Plusieurs techniques de multiplication existent, chacune avec leurs avantages et inconvénients.

27. Le sevrage • C'est la mise en terre, le passage des conditions de laboratoire aux conditions de serre. Cette phase s'avère souvent critique, car les plantes en tubes ont perpétuellement leurs stomates ouverts (pores permettant les échanges gazeux ~oxygène, CO2, vapeur d'eau~ entre la plante et son environnement), et ne savent plus les fermer. Même les plantessucculentes peuvent sécher si le changement d'environnement se fait trop brusquement.En prenant quelques précautions, le taux de survie atteint les 100%.

28. Les tubes ouverts sont placés dans une serre sous brouillard sec (fine brumisation de gouttes si fines qu'elles ne se déposent pas) pendant 2 jours.Les plantes sont sorties de leur milieu de culture, les racines sont nettoyées, puis elles sont mises en terre, placées à nouveau dans un lieu très humide pour une semaine, puis elles prennent place dans une serre normale.

29. Les plantes enracinées sont placées dans un substrat spécial, placées sous cloche (ou film plastique), et arrosées un jour sur deux durant deux semaines. Enfin, elles sont rempotées dans leur pot définitif avec un substrat adéquat.

30. III/NOS EXPERIENCES

31. LE PROTOCOLE

32. LA CULTURE IN VITRO DE GERANIUM REMARQUES • Se laver les mains • Désinfecter le plan de travail à l’eau de javel • Manipuler près de la flamme du Bec Benzen Désinfection de la plante • prélever une feuille • la rincer à l’eau du robinet • placer la feuille quelques minutes dans un agent mouillant • désinfecter pendant 5 minutes dans une solution de javel

33. La feuille étant désinfectée, les étapes suivantes sont réalisées près du Bec Benzen et avec des instruments totalement stériles : • Faire 4 rinçage de 5 minutes dans de l’eau distillée • Découper un carré de la feuille • Ouvrir le flacon stérile et déposer le bouchon sur une soucoupe imbibée de javel • Déposer la feuille dans le flacon avec des gestes lents et près du Bec Benzen • Refermer le flacon

34. CULTURE IN VITRO DE LA POMME DE TERRE Respecter les mêmes règles de stérilisation qu’avec le géranium • Passer la Pomme-de-Terre sous l'eau courante pendant 5 min. pour la nettoyer. • Prélever l'extrémité d'un jeune rameau • Placer le fragment prélevé dans l’agent mouillant • Transférer l'échantillon dans l'eau de Javel et l'y laisser pendant 10 min...

35. Passer les pinces fines à la flamme • Sortir le prélèvement de l'eau de l’agent mouillant et le transférer dans l'eau stérile • Rincer pendant 2 min. dans le bocal fermé en l'agitant délicatement par rotation. • Passer les pinces fines à la flamme. • Ouvrir le flacon de Pétri stérile et y déposer le fragment. • Passer le scalpel à la flamme. • Découper l'échantillon en tronçons comportant chacun au moins deux feuilles(repérer l'orientation du tronçon). • Passer les pinces fines à la flamme • Ouvrir le flacon dans la zone stérile - Passer son goulot à la flamme - Prélever le tronçon et le planter " tête en haut" en laissant les feuilles en dehors du milieu de culture - Repasser le goulot à la flamme et refermer le flacon

37. Quelles sont les résultats de nos expériences?

38. Culture in vitro de géranium Tous nos plans ont raté car le fragment de feuille de géranium a séché sur le milieu de culture, nous n’avons donc aucun résultat positif pour cette expérience. De plus nous ne pouvons pas expliquer ce qu’il a pu se passer pour que les feuilles sèchent. Nous n’auront malheureusement pas de géranium à offrir cette année ! On peut voir ici que le fragment de feuille a séché.

39. Culture in vitro de pommes de terre - Les résultats sont différents selon les milieux de culture mais nous savons pourtant que la gélose n’est pas la source de nos résultats ratés. Les expériences ont été réalisé dans de bonnes conditions puisque nous avons constaté que nos plans avaient pourri trois semaines après nos expériences, on peut donc en déduire que l’élément qui a fait que nos cultures n’aient pas marché est un élément extérieur pouvant provenir de l’air qui nous entoure. - Nous avons remarqué que les cultures se trouvant en milieu neutre ont eu des résultats très favorables. - Les plants se trouvant en milieux qui contiennent de l’auxine et de la cytokinine n’ont pas du tout marché, les germes ont pourri. Cette culture aurait du nous montrer le développement d’un cal. - Sur les deux plants se trouvant en milieux contenant de la cytokinine un seul s’est développé tandis que l’autre a montré des traces de moisissures. La cytokinine développe la croissance des feuilles. - Les milieux contenant de l’auxine et des sels minéraux nous ont donné de beaux plans. On aurait du remarqué le développement de racines

40. V/QUELLES SONT LES DIFFERENTES TECHNIQUES DE CULTURES IN VITRO?

41. La micro propagation ou le clonage végétal • Les plantes se reproduisent par la voie sexuée via les graines, mais elles utilisent pour certaines aussi une autre voie, celle de la multiplication végétative. La particularité de cette reproduction est que les plantes filles qui en sont issues sont identiques génétiquement à la plante mère: c'est le clonagevégétal ou multiplication conforme qui est exploitée depuis des siècles par les horticulteurs et jardiniers : bouturage, marcottage, greffage etc. • La micro propagation in vitro dérive de ce phénomène naturel. On cultive des explants végétaux stérilement, sur un milieu artificiel et dans un environnement contrôlé. Suite aux subcultures successives on obtient alors des plantes identiques à la plante de départ et que l'on peut multiplier à l'infini.

42. La culture de méristèmes ou l'élimination de virus • Les méristèmes sont des zones de cellules à divisions intenses, situées au cœur des bourgeons et des extrémités de racines et à l'origine des tiges feuillées ou du système racinaire. • En 1950, les travaux de Limassetet Cornuet ont montré que les méristèmes étaient indemnes de virus.

43. La culture de méristème est une culture aseptique du dôme apical sans ébauche foliaire sur milieu artificiel. Il mesure 0,2 à 0,3 mm de côté et la dissection se fait sous loupe binoculaire. La technique peut être associée à de lathermothérapie: culture à température élevée, pour favoriser l'élimination des virus. • C'est la seule façon d'obtenir des plantes saines indemnes de virus.

44. L'embryogenèse somatique • L'embryogenèse somatique est une forme de multiplication végétative qui permet d'obtenir une multitude de plantules identiques génétiquement à la plante donneuse d'explants. • C'est l'obtention d'embryons à partir de cellules somatiques, c'est à dire non sexuelles.

45. De nombreuses divisions cellulaires sont rapidement provoquées à partir des tissus cultivés grâce à l'apport d'une forte dose d'auxine. Un cal est alors obtenu, c'est à dire un amas de cellules indifférenciées et qui pourront donner naissance à des embryons bipolaires qui vont se comporter comme des embryons zygotiques, (issus de la fécondation entre une cellule sexuelle femelle et une cellule sexuelle mâle).

46. QUELS INCONVENIENTS?

47. On peut obtenir des plantes malformées si on ne suit pas rigoureusement la technique (milieux de culture, équilibre hormonal, cycle de repiquage, conditions de lumière, de température...).

48. ENVIRONNEMENT STERILE DES PRECAUTIONS DE BASES SONT REQUISES POUR REPIQUER ET CONSERVER LES CULTURES. LE MOINDRE MICROBE PEUT CONTAMINER LES CULTURES LORS DE L'INSTALLATION DES BOUTURES OU DES GRAINES

50. Action des moisissures Action des moisissures