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GK-07

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  1. GK-07

  2. DENATURACION de PROTEINAS Calor Microondas UV radiación Agitación fuerte Detergentes Metales pesados Solvente orgánicos Ácidos y bases fuertes Sales efecto de > Temperatura > pH > detergente > sustancias solubles en agua

  3. Preparación de proteínas factor atención durante la preparación evitar alta temperatura, dejar en HIELO temperatura congelar-descongelar determinar el efecto de congelar, agregar glicerol al tampón, guardar alicuotado no agitar, usar vortex vigorosamente mezclar, nunca introducir burbujas denaturación física mantener conc. > 1mg/ml incluir 0,1 – 1mM DTT en el tampon incluir 1 – 10mM EDTA en el tampon utilizar soluciones estériles, incluir anti-microbianos, y/o congelar incluir inhibidores de proteasas, mantener en HIELO efecto de dilución oxidación metales pesados crecimiento de bacterias proteasas

  4. PURIFICACION DE PROTEINAS • necesario para revelar su estructura • desarrollo de inhibidores • desarrollo de vacunas • aislar proteínas recombinantes para vacunas • - etc...

  5. Vacuna de proteína recombinante Vacas clonadas y geneticamente modificada produce proteína en su leche (Alan Trounson, Australia) Diseño de drogas Taste receptors

  6. Estrategia de purificación de proteínas • selección del tejido • homogenización • clarificación – precipitación • solubilización y PURIFICACIÓN • - captura • purificación mediana pureza • purificación, ultra pureza • necesario test para monitorear ej. detección inmunológica o test funcional

  7. Max Perutz, hemoglobina John Kendrew, mioglobina,

  8. Cachalote (Physeter catodon) 17,8 kDa

  9. Rayos X, desviación, reconstrucción de la desviación,

  10. Localización de los átomos

  11. Ej: A el Partenon; B es un esquema de difracción del Partenon, C y D imágenes reconstruidas con los datos de B.

  12. Revelar ESTRUCTURA NATIVA (terciaria)  FUNCION Para obtener cristales  proteína pura

  13. Proteína, Purificación • Fraccionamiento celular • Centrifugación • Cromatografía intercambio iónico, carga, depende del pH • Cromatografía exclusión por tamaño • Cromatografía de afinidad, ligando de la proteína a un “bead”, selectivo, unión proteina-proteina

  14. Fraccionamiento celular

  15. MICRÓFUGA SECCIÓN DE UNA CENTRÍFUGA PREPARATIVA TIPOS DE CENTRÍFUGAS DE BAJA VELOCIDAD DE ALTA VELOCIDAD ULTRACENTRÍFUGA

  16. TIPOS DE ROTORES ROTORES FLOTANTES centrífuga baja velocidad Ultracentrífuga ROTORES DE ÁNGULO FIJO Ó ANGULARES ROTOR VERTICAL

  17. HOMOGENEIZADO SOBRENADANTE CENTRIFUGACIÓN PELLET ANTES DESPUÉS ROTORES FLOTANTES • Centrifugación diferencial: • En gradiente de densidad:

  18. Fraccionamiento celular

  19. Fraccionamiento celular

  20. Fraccionamiento celular

  21. Fraccionamiento celular

  22. CROMATOGRAFIA • por carga: intercambio iónico • ej. DEAE (+), CM (-) • por tamaño: exclusión, los grandes primero • ej. Sephadex = filtración por gel • por especificidad: afinidad entre proteína-proteína • ej. anticuerpo

  23. CROMATOGRAFIA DE INTERCAMBIO IONICO

  24. Ej. intercambiador cationico proteínas con carga positiva se unen al soporte que tiene carga negativa las proteínas con carga negativa pasan de largo

  25. Cromatografía de Intercambio Ionico

  26. CM-agarosa CARGA NEGATIVA carboximetil-agarosa

  27. DEAE-columna CARGA POSITIVA Dietilaminoetil

  28. CROMATOGRAFIA DE INTERCAMBIO IONICO • Intercambio iónico • - intercambiador cationico • (tiene carga negativa, ej.carboximetil CM-) • proteínas con más carga neta negativa pasan más rápido por la columna • intercambiador aniónico • (tiene carga positiva, ej. DEAE+) • proteínas con más carga neta positiva pasan más rápido por la columna

  29. CROMATOGRAFIA DE EXCLUSION

  30. Cromatografía de filtración en gel

  31. Cromatografía de filtración en gel

  32. DIALISIS Separación por tamaño eliminación de sal

  33. bolsa de diálisis solución concentrada tampón en equilibrio al principio de la diálisis

  34. CROMATOGRAFIA DE AFINIDAD

  35. Cromatografía de Afinidad

  36. Proteína retenido por interacción con ligando Elusión por adición de exceso de ligando

  37. Perfil del aumento de la actividad especifica de una proteína durante la purificación

  38. Las proteínas se separan por - carga eléctrica - tamaño y forma ELECTROFORESIS electro-foresis; del griego, estar llevado Def.: - Migración de una sustancia por la acción de un campo eléctrico - Técnica que aplica este fenómeno

  39. el  -mercaptoetanol va a “romper” los enlaces –S–S– tanto inter- como intramoleculares mediante una reacción redox ( -mercaptoetanol reduce los enlaces disulfuro) A2 b-mercaptoetanol HS S + S SH A1 A1 A2 El DTT funciona del mismo modo que el -mercaptoetanol

  40. Carga de los aminoácidos y proteínas con los cambios de pH a pH alcalino la mayoría de las proteínas va estar cargada negativamente

  41. – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – El SDS se va unir a las proteínas dotándolas de una alta carga eléctrica negativa, la cual por repulsión va a provocar el desplegamiento de las mismas SDS SH La cantidad de SDS unido a la proteína es proporcional a su tamaño, de tal forma que la relación carga/tamaño entre todas las proteínas va a ser aproximadamente la misma (1.4gSDS/gproteina)

  42. CÁTODO Fuente de poder reservorio de tampón superior e inferior única conexión eléctrica vía el gel Electrodo de platinum + ÁNODO electrodo de platinum