1. Pathologie moléculaire du carcinome hépatocellulaire

2. Pathologie conventionnelle • classification descriptive basée sur des critères morphologiques • Facteurs pronostiques clinicopathologiques • Pathologie moléculaire : • Recherche cognitive (physiopathologie) • Recherche appliquée (marqueurs, traitements….)

3. Les outils de la pathologie moléculaire-omics : Géne Protéine ADN / genome Transcription ARN / transcriptome Traduction Proteine / proteome, métabolome CGH array, séquençage, SNP. Microarray, q-PCR Spectrométrie de masse

4. CHC et pathologie moléculaire Nouveaux outils • Nouveaux concepts • Nouveaux marqueurs • Nouveaux traitements

5. Pathologie moléculaire et CHCNouveaux concepts • Histogenèse (origine cellulaire) des CHC • Hépatocytes : cellules très différenciées mais qui répondent à une agression par une prolifération soutenue - un candidat pour origine du CHC • Cellules souches : un compartiment de cellules progénitrices résidentes avec capacité de prolifération infinie - un autre candidat pour l’origine du CHC • Cellule originelle du CHC: cellules progénitrices ou hepatocytes différenciés ?

6. Cellules progénitrices résidentes (cellules souches) Cell. Progénitrice Cell. Progénitrice Hépatocyte Cell. Progénitrice Hépatocyte

7. Le concept des cellules souches cancéreuses • Seul un % limité de cellules cancéreuses peuvent donner lieu à la croissance d’un cancer après xenotransplantation de cellules cancéreuses humaines chez des souris Nude • Ces cellules cancéreuses ont un phénotype de cellules souches (c-kit, sca-1, Thy-1, CD34, EpCAM, NCAM…..(Bonnet D et al Nat Med 1997….) Adams, J. M. et al. Cancer Res 2008;68:4018-4021 • Les Cellules Souches Cancérisées (CSC) après mutations oncogéniques seraient la source du cancer et permettraient sa propagation (implications thérapeutiques++)

8. Le concept des cellules souches cancéreuses • Modèles expérimentaux : • Extraction de cellules ovales (souches) p53-/- • Transduction ex vivo avec c-myc, pAKT, or H-Rasv12 • Réimplantation dans le foie de souris receveur (Zender L, Cell 2006) Il est possible d’induire des CHC à partir de cellules souches « cancérisées »

9. Le concept des cellules souches cancéreuses CHC humain p53 -/-, c-myc β-catenin (mutant) Bmi1 Chiba T et al Gastroenterology 2007 Zender et al, Cell 2006 Les CHC induits par des CSC ont des phénotypes particuliers

10. Rôle des cellules souches dans l’histogenèse des carcinomes hépatocellulaires humains(Lee et al. Hepatology 2004, Nat Med 2006) • Hypothèse : profil d’expression génique d’un cancer renseigne sur son histogenèse • Analyse transcriptomique des CHC humain : • Profil type hépatocytaire • Profil type hépatoblastique • Les CHC de phenotypehepatoblastique expriment les marqueurs de cellules progénitrices: CK7, CK19, Vimentine • Pronostic pejoratif des CHC de type hepatoblastique

11. Marqueurs de cellules progénitrices et carcinomes hépatocellulaires • CHC avec phénotype CK7 +, CK19 + : • 10-50% des CHC expriment un phenotype biliaire/souche (Wu et al Am J Pathol 1996, Van Eiken, Hum Pathol 1988… ) • Pronostic pejoratif avec récidive rapide après ttmt chirurgical et survie plus courte(Uenishi Cancer Sci 2003, Durnez et al, Histopathology 20006, P. Newell et al. ILCA 2008, O-007)

12. CK-19

13. Mais….. • Adéquation des modèles expérimentaux ? effet sélectif du microenvironnement • Rôle sélectif du microenvironnement dans le modèle de xénogreffe (homme → souris) • Dans un modèle syngénique (souris → souris), la transplantation de cellules cancéreuses est efficace avec la majorité des cellules tumorales • Ces cellules fondatrices ont un phénotype différencié (Kelly PN et al Science 2007, Adams et al, Cancer Res 2008) • Les petits CHC et les lésions préneoplasiques de haut grade présentent un phénotype d’hépatocyte différencié

14. CHC différencié invasion stromale Autre hypothèse : Le CHC se développe à partir d’hépatocytes matures cancérisés

15. Transformation des hépatocytes différenciés Rôle des télomères TTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG Télomere TTAGGGTTAGGGTTAGGG TTAGGGTTAGGG TTAGGG REPLICATIVE SENESCENCE

16. stress oxydatif Nécrose/Regeneration Raccourcissement Télomérique accéléré p53 DNA damage signals Arrêt du cycle cellulaire Senescence réplicative Apoptose “crise”fusions, cassures chromo. , instabilitégénomique Programmeélongationtelomères

17. Raccourcissement télomérique et réexpression de la télomérase Télomerase Réexpression de la télomerase : - Un événement très rare au cours du vieillissement physiologique - Un événement plus fréquent dans le contexte d’un racourcissement télomérique accéléré (hépatite chronique, cirrhose) - réacquisition d’une capacité proliférative indéfinie et non régulée

18. Télomérase et Cirrhose Clonalité et cirrhose M P P M M P P M P P M M P P M P N Youssef et al J.Pathol 2001;194:459-465 V Paradis, et al. Lab Invest. 2000 Oct;80(10):1553-9. Ochiai T et al. Hepatology 2000;31:615-621

19. Histogenèse des CHC Cellules souches Hépatocytes Differenciés Hepatoblastome Hepatocholangiocarcinome Carcinome Cholangiolocellulaire* CHC CK19 + La plupart des CHC * Komuta M et al Hepatology 2008 Différentes origines cellulaires → nouvelles cibles thérapeutiques personnalisées (CSC, Telomerase)

20. Pathologie moléculaire et CHC • Nouveaux marqueurs

21. Classification histologique des nodules hépatiques sur cirrhose (< 2cm) • Macronodule Régéneratif (LRN) • Nodule Dysplasique de bas grade (LG-DN) • Nodule Dysplasique de haut grade (HG-DN) • Petit CHC (early HCC) Nodule dysplasique / petit CHC : - importance pour prise en charge - Dc différentiel histopathologique difficile ICGHN, Hepatology, In press

22. Etudes transcriptomiquesnodules dysplasiques vs CHC précoce • Analyse transcriptomique différentielle par microarray à partir de fragments tissulaires congelés • 3 gènes discriminants : LYVE1, Glypican-3, Survivine Llovet J et al. Gastroenterology 2006

23. Glypican 3 • Heparan sulfate proteoglycans: • Récepteur membranaire • Co-récepteur pour facteurs de croissance • Prolifération cellulaire, Différenciation et Migration • Protéine Oncofoetale: •  Foie Fœtal,  Foie Adulte,  CHC • Développement d’un Ac Monoclonal Capurro Gastroenterology 2003, Lin Cancer Res 1999, Xiang Oncogene 2000, Sung Cancer Sci 2003

24. Glypican 3 CHC CIRRHOSE

26. GPC 3 et lésions précancéreuses % of GPC3 + immunostaining % 88% 22% 0% 3% 0% Wang et al, Hum Pathol 2006

27. Etudes transcriptomiques (microarray) dans les CHC évolués • Classification moléculaire des CHC en fonction du patron d’expression génique, des voies de signalisation altérées ou de l’expression des microARN(Boyault S et al Hepatology 2007, Lee 2004, Katoh et al Hepatology 2007) (S. Toffanin et al. ILCA 2008 – 0-010) • Analyses transcriptomiques à visée pronostique : signatures géniques pour • Survie globale(Lee, Nat Med 2004) • Récidive après resection(Iizuka N et al Lancet 2003) • Différenciation, nodules satellites, invasion vasculaire(Cheb, Mol BiolCell 2002, Okabe, Cancer Res 2001, ILCA 2008, B. Minguez O-020) • Beaucoup de gènes, peu de tumeurs : en attente de travaux de validations

28. Protéomique et Pathologie moléculaire • Une approche séduisante : étude de l’effecteur cellulaire • Une technologie complexe : • Multiplicité (1.106 to 5.106 proteines) • Diversité (MW : 500 Da – 800.000 Da) • Concentrations (1 – 106) • Résultats préliminaires prometteurs pour l’identification de biomarqueurs et de cibles thérapeutiques

29. MALDI – IMAGING Sauer S et al. Nature Review Genetics, 2005

30. X

33. MALDI – Imaging in HCC • Global immunohistochemistry without antibody • Identification of new biomarkers • Insight into cognitive research in HCC (invasion, early stages……)

34. REMERCIEMENTS Centre de Recherche Biomédicale Bichat-Beaujon, INSERM UMR 773Valérie ParadisDelphine DargèreMiguel AlbuquerqueNathalie Youssef, Magalie ColombatSophie Ferlicot, Nathalie GuedjHôpital BeaujonJacques Belghiti, Françoise DegosDominique Valla, Valerie Vilgrain Sandrine Faivre