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EXPERIÊNCIA DA FUNDAÇÃO PRÓ-SANGUE COM O TESTE NAT José Eduardo Levi

EXPERIÊNCIA DA FUNDAÇÃO PRÓ-SANGUE COM O TESTE NAT José Eduardo Levi Depto. De Biologia Molecular Fundação Pró-Sangue/Hemocentro de São Paulo 07/06/2013. Porcentagem de Descarte Sorológico na FPS/HSP.

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EXPERIÊNCIA DA FUNDAÇÃO PRÓ-SANGUE COM O TESTE NAT José Eduardo Levi

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  1. EXPERIÊNCIA DA FUNDAÇÃO PRÓ-SANGUE COM O TESTE NAT José Eduardo Levi Depto. De Biologia Molecular Fundação Pró-Sangue/Hemocentro de São Paulo 07/06/2013

  2. Porcentagem de Descarte Sorológico na FPS/HSP 1991Int.: ALT, HCV, HTLV; 1992 Int. ELISA Sífilis; 1993 Ret. Fix Complemento; 1994 Int. HBc e Informatica; 2001 Ret. HA Chagas; 2003 Ret. VDRL; 2004 Ret. ALT e IFI Chagas; Int. HIV Combo; 2008 Int. HCV Combo; 2011 Int. NAT HIV/HCV

  3. Porcentagem de Descarte - HIV Teste em uso e critério: ELISA – Ag + Ac – Biorad (± 10%) CMIA - Ag + Ac – ArchitectAbbott ( - 10%) Obs.: 2004 ELISA Ag + Ac 2011 NAT

  4. Porcentagem de Descarte - HCV Teste em uso e critério: ELISA – Ag + Ac – Biorad (± 10%) Obs.: 2008 ELISA Ag + Ac 2011 NAT

  5. FPS 2010 ANTI-HCV= 0.32% ANTI-HIV= 0.18%

  6. 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Marcadoressorológicos e molecularesnainfecçãorecentepelo HIV-1 RNA plasmático DT = 21.5hrs Anticorpos anti-HIV 1ndgen 2nd gen Antígeno p24 3rd gen “blip” viremia 11 16 22 InfectividadeteóricaDia 0RNA viral Dia 11 Antígeno p24 Dia 16 Anticorpos anti-HIV Dia22

  7. 11.3/MILHÃO = 1:88.500

  8. “Eu penso que doar sangue é uma maneira boa, rápida e anônima de ter um teste de sangue” “Eu doo sangue para ter meus resultados” Entre 3061 participantes, 208 (7%) se encixaram na definição de “buscadores de teste”!

  9. 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Marcadoressorológicos e molecularesnainfecçãorecentepelo HIV-1 RNA plasmático DT = 21.5hrs Anticorpos anti-HIV 1ndgen 2nd gen Antígeno p24 3rd gen “blip” viremia 11 16 22 InfectividadeteóricaDia 0RNA viral Dia 11 Antígeno p24 Dia 16 Anticorpos anti-HIV Dia22

  10. Teste de Ácido Nucléico (NAT) Portarias do Brasil • Port. 262 M.S. 02/2002 - introdução do NAT em 6 meses: 1 laboratório por estado “pool” de 8 amostras • Port. 1407 M.S. 08/2002 – adiada por 6 meses: Alto custo do teste. Incapacidade de organizar todos laboratórios • Port. 79 01/2003 - adiada por 1 ano • Port. 112 01/2004 - Dispõe sobre a implantação, no âmbito da Hemorrede Nacional, da realização dos testes de amplificação e detecção de ácidos nucléicos (NAT), para HIV e HCV. Art. 1º Determinar a implantação, em etapas, no âmbito da Hemorrede Nacional, da realização dos testes de amplificação e de detecção de ácidos nucléicos (NAT), para HIV e para HCV, nas amostras de sangue de doadores.

  11. Plataforma multiplex para HCV e HIV; Pool de 6 amostras; 2008 - estudos-piloto - SC 2010 - Estudos multicêntricos (outros hemocentros brasileiros: SC, PE, RJ e SP) para aprovação, validação e logística. Registro em 12/2010 01/05/2011 – Início oficial nos hemocentros de SC, PE, RJ e SP 14 Sítio Testadores (tds iniciaram falta BA). Plataforma de testes NAT Bio-Manguinhos

  12. blood units/day (based on the # of serology tests) 30 ¬ 100 100 ¬ 200 200 ¬ 400 400 ¬ 800 800 ¬ 1000 1000 ¬ 1500 1500 ¬ 2000  Belém, 349  Manaus, 376 Fortaleza, 646  Recife, 942  Salvador, 438 Brasília, 773   B.Horizonte,  1192 Campo Grande, 629  São Paulo 1923 •   Rio de Janeiro, 1083 Curitiba, 769 Florianópolis, 1115 BUT … São Paulo State – due to size and complexity … will be addressed further ! • How to? • Choice of Blood Center Labs where NAT will be installed – Centralized system based on: • Easiness for primary tube logisticsand report return within platelet saving time (<24h) • Throughput capacity and infra-structure of labs from Main Blood Centers within each micro-region already established for serology tests.

  13. Manual Operacional NAT • Sítio Testador (SIT) • 24 horas para resultado após o recebimento • Encaminhar tubo para coleta • Relatórios CGSH e Bio-Manguinhos • Unidade Referenciadora de Amostra (URA) - encaminhar amostra, soroteca e da sorologia • Relatório para o SIT • Distribuição dos tubos para UCA • Coleta e centrifuga amostra • Conservar em geladeira • Unidade Coletora de Amostra (UCA) • Relatório para a URA • Coleta e centrifuga amostra • Conservar em geladeira

  14. Plataforma de testes NAT Bio-Manguinhos Extração – 2h e 30min Pooling – 2h 30 min - 20ºC 30 min + 22ºC Amplificação–3h PCR Setup –30min Tempo total 9h

  15. NAT – Bio-Manguinhos - Etapas do teste Tubo primário - PPT Pool – 6 amostras Plataforma automática Janus Perkin Elmer

  16. Protocolo de rotina

  17. NAT – Bio-Manguinhos - Etapas do teste Adição dapartícula calibradora Extração –Biorobô MDx (T. lise e protease, temp 65ºC) Amplificação + Detecção (HIV, HCV part calibradora) –PCRtempo real Applied Biosystems 7300

  18. NAT FPS Total 532.700 doações

  19. Amostra Janela HIV – Retrovigilância (Soroteca) - Processada dia 17 de março de 2011 • Amostra em SINGLE • Ct: 32,54

  20. HIV 28 amostras não são Janela Imunológica – falso positivo do NAT

  21. SOROCONVERSÃO - HIV gp120 envelope gp41 Doador: esporádico – 11 doações na FPS/HSP Última Doação Negativa: 02/08/2011 Sexo: masculino Idade: 36 anos matriz transcriptase reversa RNA viral capsídeo Banda controle p17 p24 gp120 gp160 Teste de Western Blot: MP Diagnostics: HIV BLOT 2.2 CCR5 CD4 CXCR4 Testes : Abbott: HIV Ag/Ac COMBO Quimioluminescencia BioRad: Genscreen “ULTRA HIV Ag-Ab (ELISA)”

  22. Teste NAT - 17/04/2013 Pool de 6 amostras - CT: 34,6374

  23. Teste NAT - 18/04/2013 Amostra única - CT: 32,8703

  24. Teste NAT - 03/05/2013 Amostra única – CT: 17,856

  25. Teste NAT - 17/05/2013 Amostra única – CT: 22,848

  26. RENDIMENTO PROJETADO PARA HIV WP NAT – MP NA FPS = 4.2/MILHÃO = 1:238.000 OBSERVADO = 1: 328.000

  27. RENDIMENTO NAT NO BRASIL LEVI ET AL., HEMO 2011

  28. RISCO HIV –TX PRÉ-NAT MP NA FPS = 1:88.500 RISCO HIV –TX PÓS-NAT MP NA FPS = 1:156.000

  29. HIV transfusion transmission despite NAT testingNanci Salles, José E. Levi, Cláudia C. Barreto, Camila M. Romano, Luciana Sampaio, Ester C. Sabino and Alfredo Mendrone Jr. Transfusion, 2013, in press Receptor – Em Novembro 2011 apresentou sorologia e NAT + para HIV Em Julho 2011 a sorologia anti-HIV era negativa. Entre Agosto e Novembro Recebeu 47 transfusões com unidades da FPS. Todas as doações correspondentes foram re-testadas com NAT individual, sendo todas negativas. Os doadores foram reconvocados, 37 compareceram. Um doador apresentou soroconversão para HIV e NAT+.

  30. HIV transfusion transmission despite NAT testingNanci Salles, José E. Levi, Cláudia C. Barreto, Camila M. Romano, Luciana Sampaio, Ester C. Sabino and Alfredo Mendrone Jr. Transfusion, 2013, in press Doador, Homem, 22 anos, 3ª doação espontânea na FPS

  31. HIV transfusion transmission despite NAT testingNanci Salles, José E. Levi, Cláudia C. Barreto, Camola M. Romano, Luciana Sampaio, Ester C. Sabino and Alfredo Mendrone Jr.Transfusion, 2013, in press CARGA VIRAL ESTIMADA POR PROBIT ANALYSIS Entre 3.7 – 7.5 UI/mL

  32. 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Marcadoressorológicos e molecularesnainfecçãorecentepelo HIV-1 RNA plasmático DT = 21.5hrs Anticorpos anti-HIV “blip” viremia 1ndgen 2nd gen Infecção Antígeno p24 3rd gen 11 16 22 InfectividadeteóricaDia 0RNA viral Dia 11 Antígeno p24 Dia 16 Anticorpos anti-HIV Dia22

  33. jelevi@prosangue.sp.gov.br

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