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Protéomique

Protéomique. Protéome = ensemble des protéines d’une cellule, ou d’une organelle, à un instant donné (et donc sous des conditions données). Connaissance du génome n’implique pas la connaissance du protéome (régulation de la transcription, de la traduction, de la localisation cellulaire, etc.).

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Protéomique

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  1. Protéomique Protéome = ensemble des protéines d’une cellule, ou d’une organelle, à un instant donné (et donc sous des conditions données) Connaissance du génome n’implique pas la connaissance du protéome (régulation de la transcription, de la traduction, de la localisation cellulaire, etc.) Connaissance du transcriptome n’implique pas la connaissance du protéome (régulation de la traduction et de la localisation cellulaire, durée de vie des protéines, etc.) Schizosaccharomyces pombe http://www.nature.com/msb/journal/v3/n1/fig_tab/msb4100117_F3.html

  2. Protéomique Génome = ensemble des gènes d’un organisme, ou d’une espèce Protéome = ensemble des protéines d’une cellule, ou d’une organelle, à un instant donné (et donc sous des conditions données) Y-a-t-il un parallèle complet entre génomique et protéomique ?

  3. Génome versus Transcriptome et Protéome http://www.defl.ca/~debloisj_dev/cellules/images/Cell_fundp.ac.be/cellule.jpg http://www.ac-grenoble.fr/xmallet/IMG/gene_proteine.jpg

  4. Protéomique Génome = ensemble des gènes d’un organisme, ou d’une espèce Protéome = ensemble des protéines d’une cellule, ou d’une organelle, à un instant donné (et donc sous des conditions données) Y-a-t-il un parallèle complet entre génomique et protéomique ? Génome : taux d’erreur de la réplication, ~10-7 modifications de la chromatine (méthylation, etc.) • Protéome : taux d’erreur de la transcription, 10-4 - 10-5 • erreur/polymorphisme de l’épissage • erreur/polymorphisme de l’édition • erreur de la traduction, 10-4 • repliement • modifications post-traductionnelles (irréversible/réversibles) • localisation cellulaire

  5. Électrophorèse 2D http://www-lmmb.ncifcrf.gov/phosphoDB/2d-description.gif

  6. Electrophorèse 2D http://www.bio.davidson.edu/COURSES/genomics/2003/clement/Cox5b_Mouse%20Liver%202D%20Gel.jpg

  7. DIFFÉRENTES VISIONS DE LA PROTÉOMIQUE • Protéomique fonctionnelle : interactions protéines-protéines (double-hybride, PCA, Tap-Tag MS-MS, etc.), etc. • Protéomique structurale : structure tridimensionnelle de toutes les protéines (cristallographie, RMN, etc.) • Pharmacoprotéomique • Etc. • --> description de toutes les protéines à un instant t en utilisant la spectrométrie de masse

  8. http://assoxenope.free.fr/cours/proteomique.pdf

  9. http://assoxenope.free.fr/cours/proteomique.pdf

  10. http://assoxenope.free.fr/cours/proteomique.pdf

  11. http://www.erudit.org/revue/ms/2004/v20/n5/008428arf001n.jpg

  12. http://assoxenope.free.fr/cours/proteomique.pdf

  13. http://assoxenope.free.fr/cours/proteomique.pdf

  14. http://assoxenope.free.fr/cours/proteomique.pdf

  15. Le peptide trypsique Se termine par une Lysine ou une Arginine donc 2 sites basiques protonables par peptide : le NH2 terminal et le NH2 de la chaîne latérale de la Lys ou de l’Arg R1 R3 O O C C C NH C NH C C OH NH3+ NH C C O O CH2 R2 (CH2)3 NH3+ Lysine coursenligne.u-strasbg.fr/depotcel/DepotCel/279/Intranet/Carapito.ppt

  16. http://assoxenope.free.fr/cours/proteomique.pdf

  17. http://assoxenope.free.fr/cours/proteomique.pdf

  18. http://pbil.univ-lyon1.fr/events/jobim2005/presentations/vandenbrouck.pdfhttp://pbil.univ-lyon1.fr/events/jobim2005/presentations/vandenbrouck.pdf

  19. Désorption-ionisation laser assistée par matrice Matrix-Assisted Laser Desoption/Ionisation (MALDI) www.univ-lille1.fr/master-proteomique/proteowiki/images/2/23/Structure_d%27une_source_MALDI.png

  20. Désorption-ionisation laser assistée par matrice (MALDI) Avantages : * Possibilité d'ioniser des molécules de hautes masses moléculaires * Méthode d'ionisation douce : peu de fragmentation des ions moléculaires * Permet d'analyser des échantillons de faible concentration (de l'ordre de la picomole (10-12) et de la femtomole (10-15) ) * Produit principalement des ions monochargés, spectre plus simple à analyser * Grande tolérance aux sels et aux tampons Inconvénients : * Formation d'adduits (combinaison directe de 2 espèces chimiques distinctes) et d'ions de matrice http://www.univ-lille1.fr/master-proteomique/proteowiki/index.php/D%C3%A9sorption-ionisation_laser_assist%C3%A9e_par_matrice

  21. Ionisation par électrospray Electrospray Ionisation (ESI) Pression faible Pression élevée • Avantages : • molécules en solution • La multicharge permet l’étude de molécule de plus haut poids moléculaire que la limite de l'analyseur • Inconvénients : • complique l'analyse de spectre [M+nH]n+ n pouvant aller jusqu'à plusieurs dizaines m/z = (M+3)/3, (M+4)/4, (M+5)/5, (M+6)/6 http://www.univ-lille1.fr/master-proteomique/proteowiki/index.php/Ionisation_par_%C3%A9lectrospray

  22. http://assoxenope.free.fr/cours/proteomique.pdf

  23. Temps de vol Time Of Flight (TOF) m étant la masse v la vitesse l la distance parcourue pendant le vol t le temps de vol z la charge de l’ion V la tension accélératrice e étant la charge élémentaire http://fr.wikipedia.org/wiki/Spectrom%C3%A8tre_de_masse#L.27ionisation_.C3.A9lectronique_.28EI.29

  24. Le temps de vol • L'analyseur quadripolaire • Le piège ionique quadripolaire • Le FT-ICR • L'orbitrappe • L'analyseur à secteur magnétique

  25. Détecteur en spectrométrie de masse • Chambre d'ionisation • Jonction au silicium • Scintillateur • Cage de Faraday • Détecteur à induction • Multiplicateur d'électrons • Détection dans un spectromètre de masse à résonance cylcotronique • Détecteur hybride • Détecteur cryogénique http://www.univ-lille1.fr/master-proteomique/proteowiki/index.php/Portail:Spectrom%C3%A9trie_de_masse + grande diversité de fabricants  Multitudes de types d’information et de formats de fichier

  26. Spectrométrie de masse en tandem http://w3.umh.ac.be/~ichim/docs/99-05/principe.gif

  27. R R 3 1 Règles de fragmentation des peptidesBiemann, 1990 R 2 c d b a CH 2 COOH CH NH NH CO NH CH CH CO 2 v w z y x Ions de sériea, betc: charge positive portée par la partie N-terminal Ions de sériex, yet z: charge positive portée par la partie C-terminal Ions de séried, vetw: fragmentation des chaînes latérales Fragmentations basse énergie Fragmentations haute énergie Biemann K., Appendix 5, Nomenclature for peptide fragment ions (positive ions), Methods Enzymol, 1990, 193, 886-7 coursenligne.u-strasbg.fr/depotcel/DepotCel/279/Intranet/Carapito.ppt

  28. Fragmentation des peptides : La loi du proton mobile Dongré et al., Journal of Mass Spectrometry, Vol. 31, 339-350 (1996) Les peptides ne cassent qu'une seule fois pour générer préférentiellement les fragments y et b Fragments b Fragments y +ALLLFSDGR+ +A LLLFSDGR+ +ALLLFSDGR+ Fragmentation dans la cellule de collision +AL LLFSDGR+ +ALLLFSDGR+ +ALL LFSDGR+ FSDGR+ +ALLL +ALLLFSDGR+ SDGR+ +ALLLF +ALLLFSDGR+ DGR+ +ALLLFS +ALLLFSDGR+ GR+ +ALLLFSD R+ +ALLLFSDG +ALLLFSDGR+ coursenligne.u-strasbg.fr/depotcel/DepotCel/279/Intranet/Carapito.ppt

  29. Exemple de spectre MS/MS En abscisse, le rapport masse/charge ; en ordonnée, le pourcentage des ions possédant une masse donnée. En pratique, seul l'espacement entre les pics est interprété, pas leur hauteur. En interprétant ces espacements, il est possible de reconstituer la séquence peptidique. Sur cet exemple, la lecture du spectre de droite à gauche permet de reconstituer la séquence EWMPGQPR http://interstices.info/upload/proteomique/schema-spectre.gif

  30. Peptide Mass Fingerprint Concentrations as low as 10 femtomoles (10-15) Cut out 2D-GelSpot http://www.umiacs.umd.edu/~nedwards/teaching/BCHM676_Spring_2007/handouts/Lecture3.ppt

  31. Peptide Mass Fingerprint Trypsin Digest http://www.umiacs.umd.edu/~nedwards/teaching/BCHM676_Spring_2007/handouts/Lecture3.ppt

  32. Peptide Mass Fingerprint MS http://www.umiacs.umd.edu/~nedwards/teaching/BCHM676_Spring_2007/handouts/Lecture3.ppt

  33. Peptide Mass Fingerprint http://www.umiacs.umd.edu/~nedwards/teaching/BCHM676_Spring_2007/handouts/Lecture3.ppt

  34. Protein Sequence • Myoglobin GLSDGEWQQV LNVWGKVEAD IAGHGQEVLI RLFTGHPETL EKFDKFKHLK TEAEMKASED LKKHGTVVLT ALGGILKKKG HHEAELKPLA QSHATKHKIP IKYLEFISDA IIHVLHSKHP GDFGADAQGA MTKALELFRN DIAAKYKELG FQG http://www.umiacs.umd.edu/~nedwards/teaching/BCHM676_Spring_2007/handouts/Lecture3.ppt

  35. Protein Sequence • Myoglobin GLSDGEWQQV LNVWGKVEAD IAGHGQEVLI RLFTGHPETL EKFDKFKHLK TEAEMKASED LKKHGTVVLT ALGGILKKKG HHEAELKPLA QSHATKHKIP IKYLEFISDA IIHVLHSKHP GDFGADAQGA MTKALELFRN DIAAKYKELG FQG http://www.umiacs.umd.edu/~nedwards/teaching/BCHM676_Spring_2007/handouts/Lecture3.ppt

  36. Peptide Masses 1811.90 GLSDGEWQQVLNVWGK 1606.85 VEADIAGHGQEVLIR 1271.66 LFTGHPETLEK 1378.83 HGTVVLTALGGILK 1982.05 KGHHEAELKPLAQSHATK 1853.95 GHHEAELKPLAQSHATK 1884.01 YLEFISDAIIHVLHSK 1502.66 HPGDFGADAQGAMTK 748.43 ALELFR http://www.umiacs.umd.edu/~nedwards/teaching/BCHM676_Spring_2007/handouts/Lecture3.ppt

  37. Peptide Mass Fingerprint YLEFISDAIIHVLHSK GHHEAELKPLAQSHATK GLSDGEWQQVLNVWGK HGTVVLTALGGILK VEADIAGHGQEVLIR HPGDFGADAQGAMTK KGHHEAELKPLAQSHATK LFTGHPETLEK ALELFR http://www.umiacs.umd.edu/~nedwards/teaching/BCHM676_Spring_2007/handouts/Lecture3.ppt

  38. http://www.expasy.ch/pig/publi/Thesis-StevenGay.pdf

  39. Sensitivité versus spécificité PLOS Comp. Biol. (2008) 4:e12 • Sensitivité : identifier le plus de protéines (le moins de faux négatifs) • Spécificité : identifier le plus de vrais positifs

  40. Petit rappel Le Dalton est une unité de masse qui correspond à peu près à la masse d’un atome d’hydrogène. Exprimé en g, 1 Da correspond à environ 1,66 10-24 g. Glycine 75 Alanine 89 Sérine 105 Proline 115 Valine 117 Thréonine 119 Cystéine 121 Isoleucine 131 Leucine 131 Asparagine 132 Aspartate 133 Glutamine 146 Lysine 146 Glutamate 147 Méthionine 149 Histidine 155 Phénylalanine 165 Arginine 174 Tyrosine 181 Tryptophane 204 Précision de la spectrométrie de masse : 0,1 dalton à 10 daltons Modifications post-traductionnelles Acétylation 33 Méthylation 15 Glutamylation 146 Glycylation 75 Glycosylation >30 Isoprénylation >100 Phosphorylation 95

  41. Digest with specific protease Trypsin (K, R; not followed by P) Chymotrypsin (F, W, Y, L, M) Lys-C (K) Arg-C (R) Asp-N (D, N-terminal) V8-bicarb (E) V8-biphosph (E, D) {CNBr (M)} http://academic.uofs.edu/organization/IMBM/PMF_talk.ppt

  42. High specificity (K or R, not followed by P) Acetylated form commercially available (acetylation lessens autodigestion) Autolysis peaks are great internal calibrants (842.509 and 2212.11) (2254.12), guanidinated Digest with specific protease Why trypsin? http://academic.uofs.edu/organization/IMBM/PMF_talk.ppt

  43. Digest with specific protease 546 aa 60 kDa; 57 461 Da pI = 4.75 >RBME00320 Contig0311_1089618_1091255 EC-mopA 60 KDa chaperonin GroEL MAAKDVKFGR TAREKMLRGV DILADAVKVT LGPKGRNVVI EKSFGAPRIT KDGVSVAKEV ELEDKFENMG AQMLREVASK TNDTAGDGTT TATVLGQAIV QEGAKAVAAG MNPMDLKRGI DLAVNEVVAE LLKKAKKINT SEEVAQVGTI SANGEAEIGK MIAEAMQKVG NEGVITVEEA KTAETELEVV EGMQFDRGYL SPYFVTNPEK MVADLEDAYI LLHEKKLSNL QALLPVLEAV VQTSKPLLII AEDVEGEALA TLVVNKLRGG LKIAAVKAPG FGDCRKAMLE DIAILTGGQV ISEDLGIKLE SVTLDMLGRA KKVSISKENT TIVDGAGQKA EIDARVGQIK QQIEETTSDY DREKLQERLA KLAGGVAVIR VGGATEVEVK EKKDRVDDAL NATRAAVEEG IVAGGGTALL RASTKITAKG VNADQEAGIN IVRRAIQAPA RQITTNAGEE ASVIVGKILE NTSETFGYNT ANGEYGDLIS LGIVDPVKVV RTALQNAASV AGLLITTEAM IAELPKKDAA PAGMPGGMGG MGGMDF http://academic.uofs.edu/organization/IMBM/PMF_talk.ppt

  44. Digest with specific protease Trypsin yields 47 peptides (theoretically) Peptide masses in Da: 501.3 533.3 544.3 545.3 614.4 634.3 674.3 675.4 701.4 726.4 822.4 855.5 861.4 879.4 921.5 953.4 974.5 988.5 1000.6 1196.6 1217.6 1228.5 1232.6 1233.7 1249.6 1249.6 1344.7 1455.8 1484.6 1514.8 1582.9 1583.9 1616.8 1726.7 1759.9 1775.9 1790.6 1853.9 1869.9 2286.2 2302.2 2317.2 2419.2 2526.4 2542.4 3329.6 4211.4 http://us.expasy.org/tools/peptide-mass.html http://academic.uofs.edu/organization/IMBM/PMF_talk.ppt

  45. Digest with specific protease Trypsin yields 47 peptides (theoretically) Peptide masses in Da: 501.3 533.3 544.3 545.3 614.4 634.3 674.3 675.4 701.4 726.4 822.4 855.5 861.4 879.4 921.5 953.4 974.5 988.5 1000.6 1196.6 1217.6 1228.5 1232.6 1233.7 1249.6 1249.6 1344.7 1455.8 1484.6 1514.8 1582.9 1583.9 1616.8 1726.7 1759.9 1775.9 1790.6 1853.9 1869.9 2286.2 2302.2 2317.2 2419.22526.4 2542.4 3329.6 4211.4 http://us.expasy.org/tools/peptide-mass.html http://academic.uofs.edu/organization/IMBM/PMF_talk.ppt

  46. Théorie et Pratique Supposant que l’on connaisse la séquence exacte, on peut prédire une liste de peptides (et leur masse), mais on va en voir moins par MS • Digestion incomplète : • enzyme n’est pas parfait (e.g. trypsine coupe moins bien quand un a.a. basique est adjacent au site de clivage) • empêchement stérique • cinétique • Peptides perdus au cours de l’expérience : • lavages • mauvaise ionisation • Peptides supplémentaires : • contaminations • clivage non spécifique • modifications (e.g. oxydation de la méthionine)

  47. Digest with specific protease Trypsin yields 47 peptides (theoretically) Peptide masses in Da: 501.3 533.3 544.3 545.3 614.4 634.3 674.3 675.4 701.4 726.4 822.4 855.5 861.4 879.4 921.5 953.4 974.5 988.5 1000.6 1196.6 1217.6 1228.5 1232.6 1233.7 1249.6 1249.6 1344.7 1455.8 1484.6 1514.8 1582.9 1583.9 1616.8 1726.7 1759.9 1775.9 1790.6 1853.9 1869.9 2286.2 2302.2 2317.2 2419.22526.4 2542.4 3329.6 4211.4 501.3 533.3 544.3 545.3 614.4 634.3 674.3 675.4 701.4 726.4 822.4 855.5 861.4 879.4 921.5 953.4 974.5 988.5 999.7 1000.6 1196.6 1217.6 1228.5 1232.6 1233.7 1245.4 1249.6 1249.6 1344.7 1455.8 1484.6 1514.8 1582.9 1583.9 1616.8 1726.7 1759.9 1775.9 1786.2 1790.6 1853.9 1869.9 2286.2 2302.2 2317.2 2419.22526.4 2542.4 3329.6 4211.4 http://us.expasy.org/tools/peptide-mass.html http://academic.uofs.edu/organization/IMBM/PMF_talk.ppt

  48. Fragfit : une approche simple Fragfit (PNAS, 1993, 90:5011-5015 • Quel seuil choisir ? • Favorise les grosses protéines (e.g. titine, 3 Mda) Requiert une liste de peptides (et leur masse) et une base de données de séquences protéiques Calcule, pour chaque protéine, la liste théorique Calcule, pour chaque protéine, le nombre de peptides qui “matchent” (en fonction d’un seuil défini a priori) Donne la liste des protéines par ordre décroissant de nombre de matches Remplacer le nombre de fragments trouvés par la fréquence des fragments trouvés Seulement une protéine avec 5 matches parmi > 100 000 protéines Journal of the American Society for Mass Spectrometry (2003)14:931-942

  49. http://www.bioinformatics.ca/workshop_pages/proteomics/lectures/DAY2/2.4.pdfhttp://www.bioinformatics.ca/workshop_pages/proteomics/lectures/DAY2/2.4.pdf

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