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BD FACSAria Cell-Sorting System

流式細胞分選核心設施 (Cell Sorter Core Facility). BD FACSAria Cell-Sorting System. 服務項目. 常規細胞分選  Human and murine primary cells Bone marrow Tissue culture cell lines Single-cell suspensions of tumors. 2. 特殊細胞分選 除上述細胞以外之分選服務，請利用 e-mail: sorter01@ ntu.edu.tw 或電話聯絡 操作員. GFP. APC. YFP.

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Presentation Transcript

  1. 流式細胞分選核心設施(Cell Sorter Core Facility) BD FACSAria Cell-Sorting System

  2. 服務項目 • 常規細胞分選 • Human and murine primary cells • Bone marrow • Tissue culture cell lines • Single-cell suspensions of tumors 2. 特殊細胞分選 除上述細胞以外之分選服務，請利用 e-mail: sorter01@ ntu.edu.tw 或電話聯絡操作員

  3. GFP APC YFP APC-C7 DsRed Alexa 700 7-AAD APC-Alexa 700 PI ToPro3 CFSE FITC PE PE-Cy5 (CyChrome) PE-Cy7 PerCP PerCP-Cy5.5 Alexa 488 PE-Texas-Red 可使用的螢光物種 Excitation Laser 488 nm-Sapphire Laser 633 nm- HeNe Laser Fluorochrome

  4. 檢體製備 • 樣品必需事先過濾 • 使用nylon mesh (size 40 µm, Falcon cat# 352340)，或具有過濾功能之無菌管 (Falcon cat# 352235)。若未過濾樣品即上機容易引起機器堵塞及損壞。 2.各種細胞的建議濃度如下: 3. 做無菌分選時，請準備含合適培養液之收集管，於分選前交操作員。建議在15ml管中加入8 ml的medium或在5 ml管中加入2 ml的medium當細胞分選時的 (cushion)。 4.若欲分選GFP，YFP或DsRed單色基因轉染之樣品，需提供未經轉染的相同細胞為控制組標本。欲以多重螢光染色執行分選，則需提供各種單一螢光染色之標本作為分選前校正之用。 5. 本服務項目以無菌分選為主，委託服務者需提供無菌狀態之檢體。

  5. 申請流程與注意事項 步驟一：電話預約2312-3456 分機：8356 劉大鳴 或 8501 陳佳圓 1. 預約時間：每週一AM 9:00～12:00。委託服務需於前一週預約。 2. 服務時間：週一PM 1:30-5:30 (上午為機器維修時間)， 週二至週五 AM 10:00-12:00，PM 1:30-5:30。 3. 同一實驗室在一週內最多可預約2個時段，每個時段最多2小時為原則。如有特殊需求，請與本核心負責人聯繫。 4. 使用者必須在預約上機時間30分鐘內將樣品準備好，如未能在此時間內出現在核心設施則視同棄權並記一次違約。 5. 取消預約：最遲需於預約時段前一週週五PM5:00以前用電話取消預約，否則記一次違約。 6. 同一實驗室使用者若違約纍計三次，則禁止此實驗室使用此服務一個月。

  6. 步驟二：先以分析型流式細胞儀確認樣本 1. 原則上，本儀器以分選為主要服務項目，亦提供多螢光高階流式分析。 2. 建議事先使用FACSCan, FACSCalibur, FACSCanto 或其他流式細胞儀去確認細胞上染之比例及螢光強度。

  7. 步驟三：填寫【流式細胞分選服務】申請表 1. 依申請表之表一填寫基本資料，並於上機日至少三天前傳真至(02) 2391-1304或e-mail給操作員(sorter01@ ntu.edu.tw)。 2. 本核心操作員會主動與使用者聯絡並確認細節。 3. 並建議將步驟二所得到之分析資料貼入申請表之表二，於上機日繳交操作員，以利分選服務。 4. 使用者請於上機日攜帶一片光碟片(CD-ROM)以便帶回分選的電子檔。

  8. 常見問題及答覆 Q1. 上樣檢體需要溶在何種溶液中呢？是否可以就直接放在原本培養的medium呢？ A: 建議不要放medium中，因為Phenol Red及pH會影響分選的結果，一般建議放置於Sorting Buffer，配方如下: Sorting Buffer 1 × Phosphate Buffer Saline or HBSS (Ca++/Mg++ free) 1 mM EDTA 25 mM HEPES pH 7.0 1 % Fetal Bovine Serum (Heat-inactivated) 0.2 mm sterile filtered, store at 4℃ PS.依分選之細胞不同，Sorting buffer可稍做不同調整

  9. 淋巴細胞： 1x HBSS(with Ca++/Mg++)含1% FBS HBSS配方中的陽離子可增進細胞的生存力。由於這些細胞並非易於群集細胞，即便配方中沒有EDTA也不會造成問題。 較黏著的細胞(sticky cells)： 提高EDTA 到 5mM 並使用透析過的FBS (against Ca++/Mg++ free PBS)。某些細胞在活化會比較黏著而EDTA可抑制此作用。 貼壁型細胞株(Adherent cells)： 以Trypsin處理後去準備單細胞懸浮液時，待細胞變圓(切記不可過度作用)，便以5 ml 含5%血清培養液收取細胞，並均勻地打散細胞懸浮液。離心後，用sorting buffer調整細胞濃度。如果需要的話可以提高EDTA的濃度(至5mM)以避免細胞重新黏聚。 含有高比例死細胞的樣本： Sorting buffer加5mM MgCl2以及25~50 μg/mL DNAase I (Sigma D-4513)或Sorting buffer加0.83mM MgCl2以及10 U/ml DNAase II (Sigma D-4138)。這些配方可減少因死細胞釋放出來的DNA所造成的細胞黏聚現象。

  10. Q2. 如果細胞要再培養，會污染嗎？ A: 目前機器會在分選前會固定做清洗，但是因為儀器所處環境仍非無菌，故建議帶來要接收分選細胞的medium要加入抗生素，以減低污染之機率。 Q3. 如果我想在分選後拿到1x106的細胞我應該一開始準備多少細胞去做分選？ A: 假設你要的細胞佔總數的10%，則你所需準備的細胞數如下公式: 1x106=10%x 50%回收率x 20x106(起始細胞數)，所以你需要準備2x107細胞。因為分選速度、方式(purity vs. yield)及細胞在分選前狀況的好壞都會影響回收率。50%回收率是把所有因素都列入考量的最低參考值。 Q4. 通常做一次細胞分選需要多久時間？ A: 分選的過程有三個步驟，分別為設定分選區域、分選及分選後的分析。設定分選區域約需15-20分鐘。分選的時間決定於細胞數目，雖然機器的分選速度最高可達70,000細胞/sec，但為得到最佳分選結果，我們通常設定分選速度為10,000-20,000細胞/sec。因此，如欲分選2x107細胞，其所需分選時間約為17-34分鐘。分選後約需15-20分鐘去分析及列印結果。所以，總共約需1-1.2小時去分選2x107細胞。

  11. Q5. 一個樣品可以同時分選出幾種細胞? A: FACSAria可以從一個樣品中最多同時分選出四種不同的細胞。因此positive和negative的細胞也可以同時分選出來。 Q6. 可以同時使用多少參數進行細胞分選？ A: FACSAria最多可以根據九個參數去定義及分選一群細胞 (488 nm laser可偵測5種螢光訊號及SSC和FSC，633 nm laser可偵測2種螢光訊號)。 Q7. 分選後細胞的純度有多少？ A: 通常我們會預期95%以上的純度如果positive的細胞佔總數的5%以上。

  12. Q8. 如果positive的細胞佔總數的1%以下，還可以做分選嗎？ A: 可以，但是低含量細胞的分選會導致低純度及低回收率。因此，我們建議使用者事先enrich你有興趣的細胞。細胞enrichment的方式可以利用nylon wool去除B細胞，panning或是用magnetic beads (from StemCell or Miltenyi)去除不要的細胞。 Q9. 分選時所使用的tube有哪些？ A: 可使用15ml離心管(單或雙向分選)或5ml無菌管(Falcon tube #352003) with snap cap (三或四向分選)。 Q10. 可不可以把分選後的電子檔帶走？ A: 可以，由於此細胞分選儀使用FACSDiva軟體(PC界面)做分析，我們必須把結果用FCS格式輸出，使用者拿回資料後可以利用FCS converter將FCS轉換後用CellQuest軟體(Apple界面)或其他軟體做分析。

  13. Before Sorting After Sorting 94% 6% Sorting for GFP+ Cell Line

  14. Before Sorting After Sorting LSK 0.7% LSK 97% C-Kit Lin- Sca-1 C-Kit Three Color-staining for Defining and Sorting Mouse LSK Bone Marrow Stem Cell

  15. 醫學校區共同研究室 http://www.mc.ntu.edu.tw/staff/ard/ Cell Sorter Core Facility ( BD FACSAria Cell-Sorting )

  16. 台灣大學【FACSAria流式細胞分選服務】申請表-表一台灣大學【FACSAria流式細胞分選服務】申請表-表一

  17. 台灣大學【FACSAria流式細胞分選服務】申請表-表二台灣大學【FACSAria流式細胞分選服務】申請表-表二 貼入流式分析 結果圖 貼入流式分析 結果圖 SSC SSC FSC FSC % % 欲分選之細胞族群 貼入流式分析 結果圖 貼入流式分析 結果圖 FL2 FL2 % % FL1 FL1

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