Protein-Interaktionsanalysen mittels Yeast - Two -Hybrid Assay Grundpraktikum Genetik

1. Protein-Interaktionsanalysen mittels Yeast-Two-Hybrid Assay Grundpraktikum Genetik

2. Analyse von Protein-Protein Interaktionen • In vitro Methoden: • (Co-)Immunpräzipitation (zwei interagierenden Proteinen im Lysat) • Affinitätschromatographie (potentieller Interaktionspartner ist immobilisiert) • Cross-linking (chemische Verknüpfung von Partnern) • Protein-probing (markiertes Protein beweist eine Bindung) • Phage-display (Suche nach Partner in einer Bibliothek) • Protein-Chip • In vivo Methoden: • Fluorescenceenergytransfer (FRET) • Hefe-Zwei-Hybrid • Hefe-Tribrid-System • Split-YFP

3. Saccharomycescerevisiae • 1996 Genomsequenz – 1. sequenziertereukaryotischer Organismus • ~ 12 Mb, 16 Chromosomen • ~ 6000 Gene • biotechnologische Nutzung • Modellorganismus • Genetik, Biochemie, Molekularbiologie • Zellbiologie • schnelles Wachstum, leicht zu • kultivieren • leichte Isolierbarkeit, Charakterisierung • von Mutanten • nicht pathogen • stabiler haploider Zyklus • transformierbar

4. Yeast-Two-Hybrid: GAL4 Transkriptionsfaktor keine Galaktose im Medium: Galaktose im Medium: GAL80 bindet an AD von GAL4 GAL80/GAL4 Komplex bindet an UAS bindet an den Promtor Transkription der GAL-Gene unterdrückt GAL4 bindet an Promotor Transkription der GAL-Gene aktiviert

5. Yeast-Two-Hybrid: Prinzip X = Bait = Protein fürIdentifikation von Bindungs-partner X = Prey = Target für Bait z.b. Bibliothek !!!! VerwendeteHefe-Stämmehabeneinmutiertes (defektes) Gal4 !!!!

6. Yeast-Two-Hybrid: Prinzip β-Galactosidase • ins Hefe-Genomintegriert

7. Auxotrophie und Prototrophie • auxotroph: bezeichnet Organismen, die bestimmte essentielle Substanzen nicht selbstständig synthetisieren können • prototroph: bezeichnet Organismen, die alle benötigten organischen Wachstumsfaktoren (Aminosäuren, Nukleotide,…) selbst synthetisieren können

8. Yeast-Two-Hybrid: Hefestämme Klassische(genetische) Nomenklatur: ARG 2 Wildtyp Gen arg2 Mutiertes Gen arg2-9 Spezifische Mutation in Gen arg2-ΔDeletionsmutante ARG2::LEU2Disruptionsmutante Arg2p Protein Arg+ Arg prototroph Arg- Arg auxotroph a-Zelle → a-factor, α-Rezeptor α-Zelle → α-factor, a-Rezeptor

10. Yeast-Two-Hybrid: Plasmide

11. Yeast-Two-Hybrid: Transformation • Transformation: Hitzeschock bei 42°C • LiAC: erhöht Permeabilität und DNA-Bindekapazität der Zellwand • carrier DNA: bindet an die Zellwand (einzelsträngige DNA bindet effektiver als doppelsträngige DNA) • PEG: vermittelt Anlagerung des Plasmids und der carrier-DNA an • Hefezellen

12. Yeast-Two-Hybrid: Transformation • Wichtig: • Unter der Cleanbench arbeiten • Alle Lösungen und Platten nur unter der Bench öffnen • Berechnung der Plasmidmenge (1 µg für Trafo) • Bsp.: 129 ng/µl = Miniprep • 1000 ng • 129 ng/µl • !! SD-TrpfürStamm AH109 und pGBKT7-constructs • !! SD-LeufürStamm Y187 und GADT7-constructs = 7,75 µl

13. Mating und Selecting 2 3 4 6 7 8 10 11 12 13 14 15 16

14. Testen auf Protein-Protein Interaktion

15. Testen auf Protein-Protein Interaktion • Mangelmedium • SD-Leu-Trp-His: lowstringency medium • Galaktosidase-Assay • α-Galaktosidase (MEL1): wird ins Medium sekretiert MEL1UAS schwacher Promotor • β-Galaktosidase (lacZ): wird nicht sekretiert GAL1UAS starker Promotor

16. Testen auf Protein-Protein Interaktion HIS3 Gen wurde in AH109 und Y187 durch eine spezifische Mutation ausgeschaltet aber: schwache Hintergrundexpression von HIS3 → falsch Positive 3AT: 3 Amino-1,2,4 triazol kompetiver Inhibitor des HIS3 Genproduktes (Imidazolglycerol-Phosphat Dehydratase) !!! Selektives Medium ohne Histidin nötig !!!

17. Analyse von Protein-Protein Interaktionen Yeast-Two-Hybrid Analyse in S. cerevisiae Anwendungen: • Interaktion zwischen Protein 1 und Protein 2 • Interaktion zwischen Proteindomänen • Rolle einzelner Aminosäurereste für Interaktion • Identifizierung von neuen Interaktionspartnern

18. Vorteile/Nachteile des Yeast-Two-Hybrid Vorteile hoch sensitiv in vivo (keine biochemische Reinigung der Proteine nötig, postranslationale Modifizierungen) billig, robust Screening Nachteile Interaktionsstelle durch AD/BD Domäne verdeckt kann nur im Zellkern der Hefe stattfinden richtige Faltung, Stabilität der Proteine in der Hefezelle abweichende posttranslationale Modifizierungen in Hefe Protein ist toxisch für Hefe BD-Fusionprotein zeigen Interaktion (falsch Positive) zeitliche und räumliche Expression der Proteine

19. MADS I K C DNA- binding Protein-proteininteraction Transcriptionalactivation MADS-BOX Domain Proteine

20. ABC Modell – Arabidopsisthaliana A

21. ABCDE Modell – Arabidopsisthaliana

22. Liriodendrontulipifera(tuliptree) • Family: Magnoliaceae • Flower: • Monoecious • 9 tepals • smallgenomsize(784 Mbp) • Habitat: Eastern North America

23. Amborellatrichopoda A B A: femaleflower B: male flower • most basal angiosperm • Family: Amborellaceae • small, evergreen • unisexual flower : • tiny, typically about 4-8 mm • 5 – 8 tepals • wind andinsectpollination • Habitat: New Caledonia

24. zu untersuchende Proteine

25. Evolution des ABC-Models in Abhängigkeit von der Speziation der Blütenpflanzen. se-Sepalen, pe-Petalen, st-Stamina, ca-Carpell

26. Protein-Interaktionsanalysen mittels Yeast-Two-Hybrid Assay 2. Tag

27. 2. Tag • Auswertung 1. Tag • ß-Galactosidase Assay • Kolonie-PCR

28. Auswertung 1. Tag Kolonienzählen Wachstum? Wachstum? Wachstum? Was istauffällig, andersals die Erwartung?

29. Kolonie-PCR ZellaufschlussmitNaOH Primer fwd PCR Primer rv Gel PCR-Produkt

30. Mastermix • Mischung enthält alle Komponenten um mehrere Reaktionen anzusetzen. Reduktion der Pipettierarbeit und des Fehlers! • Bsp: 5 Reaktionen

31. ß-Galactosidase Assay Indigo Farbstoff • wird nicht sekretiert • Zellaufschluss mit Chloroform!!

32. ß-Galactosidase Assay Agarplatte Alufolie Chloroform Abdampfenlassen !!! Chloroform + Agar mit X-Gal 3h – 24 h

33. OrganisatorischeInfos • !!!!! Arbeiten mit Chloroform und EtBr !!!!! • 3 Freiwillige zum Gele gießen • Mittagspause nach dem X-Gal Test • Praktikum Do und Fr • Start pünktlich 8 Uhr • Bitte das Skript runterladen und LESEN!! Fragen beantworten!!! • Klausur am Freitag 15 Uhr – 16 Uhr