Caratteristiche microbiologiche, patogenetiche ed epidemiologiche di Legionella spp.

1. Dipartimento di Scienze di Sanità Pubblica Caratteristiche microbiologiche, patogenetiche ed epidemiologiche di Legionella spp. Paola Borella Dipartimento di Scienze di Sanità Pubblica Università degli Studi di Modena e Reggio E. e-mail: borella.paola@unimore.it Giornata di studio “LA LEGIONELLOSI NELLE STRUTTURE OSPEDALIERE E TURISTICO-ALBERGHIERE” Perugia, 29 ottobre 2005 Aula Magna della Facoltà di Agraria, Università degli Studi di Perugia

2. La storia Nell’estate del 1976 a Philadelphia si verificò un’epidemia di polmonite tra i partecipanti ad una riunione dell’American Legion: tra i 4.000 veterani del Vietnam presenti ( “Legionnaires”), 221 si ammalarono e 34 morirono scoperta di un “nuovo” batterio denominatoLegionella

3. Classificazione Famiglia:Legionellaceae Genere:Legionella Specie:Legionella pneumophila e altre 47 specie

4. 1. L. pneumophila15 2. L. bozemanii2 3. L. dumoffii1 4. L. micdadei1 5. L. longbeachae2 6. L. jordanis1 7. L. wadsworthii1 8. L. hackeliae2 9. L. feeleii 2 10. L.maceachernii 1 11. L.birminghamensis1 12. L.cincinnatiensis 1 13. L.gormanii 1 14. L.sainthelensi 2 15. L.tucsonensis 1 16. L. anisa 1 17. L. lansingensis 1 18. L. erythra 2 19. L. parisiensis 1 20. L. oakridgensis 1 21. L. spiritensis 2 22. L. jamestowniensis 1 23. L. santicrucis 1 24. L. cherrii 1 25. L. steigerwaltii1 26.L. rubrilucens1 27.L. israelensis1 28.L. quinlivanii2 29.L. brunensis1 30.L. moravica1 31.L. gratiana1 32.L. adelaidensis1 33.L. fairfieldensis1 34.L. shakespearei1 35.L. waltersii1 36.L. genomospecies1 37.L. quateirensis1 38.L. worsleiensis1 39.L. geestiana1 40.L. natarum1 41.L. londoniensis1 42.L. taurinensis1 43.L. lytica1 44.L. drozanskii1 45.L. rowbothamii1 46.L. fallonii1 47.L. gresilensis1 48.L. beliardensis1 Specie e sierogruppi di Legionella Fields BS. Legionella and Legionnaires’ disease: 25 years of investigation. Clin Microbiol Rev 2002;15(3):506-26.

5. Victor L. Yu et al. Distribution of Legionella species and serogroups isolated by culture in patients with sporadic community-acquired legionellosis: an international collaborative survey. J Infect Dis. 2002 Jul 1;186(1):127-8. This international collaborative survey identified culture-confirmed legionellosis in 508 patients with sporadic community-acquired legionellosis. Legionella pneumophila constituted 91.5% of the isolates. Serogroup 1 was the predominant serogroup (84.2%), and serogroups 2–13 (7.4%) accounted for the remaining serogroups. The Legionella species most commonly isolated were L. longbeachae (3.9%) and L. bozemanii (2.4%), followed by L. micdadei, L.dumoffii, L. feeleii, L. wadsworthii, and L. anisa (2.2% combined). L. longbeachae constituted 30.4% of the community-acquired Legionella isolates in Australia and New Zealand.

6. Caratteristiche morfologiche e tintoriali • Microrganismi di forma bastoncellare o coccobacillare (osservazione prelievi clinici) • Dimensioni di 0,3-0,9 m x 2-4 m (forme filamentose di 20 m e oltre in coltura) • Non sporigeni, non capsulati • Gram-negativi, si colorano debolmente in rosso con safranina • Immobili o mobili per mezzo di un flagello polare • Possiedono fimbrie

7. Caratteristiche di crescita Temperatura di crescita Legionellasi moltiplica tra 25°C e 42°C con temperatura ottimale di 35°C PH di crescita Il pH ottimale di crescita è leggermente acido ( tra 6,85 e 6,95 ), ma è tollerato un pH sino a 5,5 Respirazione Sono batteri aerobi, ma la loro crescita in terreni artificiali è favorita dalla microaerofilia ( presenza del 2,5% di CO2 ) soprattutto nel primo isolamento

8. Esigenze nutritive • Le esigenze nutritive sono soddisfatte dal citoplasma dei protozoi all’interno dei quali si riproducono alle adatte temperature • Per la loro moltiplicazione in terreni sintetici richiedono vari fattori di crescita: ferro organico, cisteina e fattori presenti nell’estratto di lievito

9. Caratteri biochimici Tabella - Caratteristiche delle specie di Legionella ________________________________________________________________________________________________ Crescita su Catalasi Ossidasi Riduzione Ureasi Acidificazione Gelatinasi -lattamasi BCYE Agar-sangue di NO3 del glucosio ________________________________________________________________________________________________ L.pneumophila + - + + - - - + + L.micdadei + - + + - - - + + L.bozemanii + - + - - - - + +/- L.dumoffii + - + - - - - + + L.gormanii + - + + - - - + + L.longbeachae + - + + - - - + + L.wadsworthii + - + - - - - + + ____________________________________________________________________________________________________________________ In terreni artificiali, le legionelle sono biochimicamente poco attive. Terreni zuccherati: non acidificati Urea: non idrolizzata Nitrati: non ridotti Gelatina: idrolizzata (tranne L. feeleii )

10. Ambiente naturale Le legionelle sono batteri dell’ambiente naturale acquatico. Sono presenti in: - Fiumi - Laghi - Stagni - Raccolte d’acqua superficiali di qualsiasi entità - Suolo umido La concentrazione delle legionelle nell’ambiente è usualmente bassa

11. Legionella sopravvive negli ambienti acquatici come parassita intracellulare di protozoi a vita libera La scoperta del ruolo dei protozoi (14 specie di amebe, tra cui Naegleria e Acanthamaebae, due specie di flagellati tra cui Tetrahymena ed una specie di muffa gelatinosa) come serbatoio per la moltiplicazione e la sopravvivenza delle legionelle ha permesso di comprendere l’epidemiologia e l’ecologia di questi batteri. A 20 °C, i protozoi fagocitano le legionelle e le digeriscono in gran numero. A 35°C, le legionelle fagocitate si moltiplicano all’interno dei protozoi.

12. Ciclo vitale di L. pneumophila • Vita libera: batteri flagellati e mobili • Aderenza alle cellule ospiti: protozoi o macrofagi • Ingestione da parte della cellula ospite • Perdita del flagello nel citoplasma • Occupazione di un vacuolo e formazione di un unico fagosoma che non si fonde con il lisosoma • Il fagosoma si trasforma in un comparto con reticolo simil-endoplasmatico • Fase replicativa: i batteri non ciliati si moltiplicano nel reticolo simil-endoplasmatico del fagosoma • Fase infettiva: il fagosoma si fonde con il lisosoma e libera batteri ciliati ed attivamente mobili • la cellula ospite muore ( i protozoi per necrosi, i macrofagi e le cellule alveolari per apoptosi o per necrosi).

13. Le legionelle, di per se stesse, sono poco resistenti agli agenti fisici e chimici • All’interno dei protozoi, e soprattutto all’interno delle cisti, sono molto resistenti agli aumenti di temperatura e ai biocidi • Nell’ambiente sopravvivono per molti mesi se sono all’interno dei protozoi

14. Ambiente urbano • - Rete di distribuzione dell’acqua • Sistemi di condizionamento e umidificatori (torri di raffreddamento/condensatori evaporativi) • Fontane decorative, impianti termali, vasche per idromassaggi, bagni turchi e aree adibite a sauna, sistemi di irrigazione, acque di scarico di impianti igienici • - Piscine e cisterne con acqua stagnante • - Apparecchiature per inalazioni Gli ambienti idrici artificiali agiscono da amplificatori e disseminatori

15. Modalità di contaminazione • Poche cellule microbiche entrano negli impianti e si riproducono (20-45°C) •  • RUOLO ESSENZIALE DELL’ACQUA CALDA

16. Fattori favorenti la colonizzazione di ambienti idrici artificiali temperatura dell’acqua fenomeni di ristagno/ostruzione incrostazioni torbidità, sostanze organiche, biofilm, Zn materiali (guarnizioni di gomma) presenza di alghe e amebe acquatiche Altri fattori sospetti durezza dell’acqua altri germi e materiali biodegradabili situazione climatica vibrazioni/cambiamenti di pressione nel sistema idrico

17. Biofilm Un biofilm è costituito da aggregati di batteri, protozoi e miceti che aderiscono a irregolarità delle pareti interne di condutture ed altre strutture a contatto con l’acqua, formando delle stratificazioni che hanno l’effetto di corrodere le pareti stesse, facilitando depositi ed incrostazioni che sporgono e tendono ad occludere le tubazioni

18. Biofilm La presenza del biofilm è essenziale per la colonizzazione da parte delle legionelle, che trovano in esso i protozoi entro cui moltiplicarsi e svolgere il loro ciclo vitale

19. Fattori di rischio aggiuntivi nelle strutture turistiche • Particolarità delle strutture turistiche • - sistema di distribuzione dell’acqua molto complesso (ogni stanza ha il bagno) con percorsi lunghi dal sito di distribuzione ai rubinetti • - soggiorni brevi, variabilità nell’uso in base alla stagione: • in alta stagione consumo di acqua concentrato in certe ore del giorno e notte (calo della T° dell’acqua) • in bassa stagione, scarso consumo o albergo chiuso con possibile ristagno che facilita la formazione di biofilm • la qualità dell’acqua erogata può variare e dovrebbe essere monitorata più frequentemente • scarsa conoscenza del problema da parte del personale dei servizi tecnici dell’hotel

20. Letteratura

21. Letteratura

22. Ruolo della flora batterica acquatica nell’ecologia microbica di L. pneumophila INTERAZIONI DIRETTE competizione e produzione di batteriocine INDIRETTE interazioni con i protozoi Nei confronti dei protozoi batteri possono: • Fungere da nutrimento  favorire le legionelle • Parassitarli  sfavorire le legionelle Screening su 72 ceppi di Pseudomonadaceae: 64% PRODUTTORI DI BATTERIOCINE attive contro L. pneumophila Messi P, Guerrieri E, Bondi M, Borella P. Interferenza microbica: quale ruolo nell’ecologia di Acanthamoeba polyphaga e Legionella pneumophila? Atti del 41° Congresso Nazionale SItI “Obiettivo salute: l’evoluzione cultuale in Europa” Genova, 20-23 ottobre 2004.

23. Interferenza microbica e sviluppo di biofilm in vitro P. aeruginosa produce PIOCINE ma non influisce su L.p. P. fluorescens  produce una BATTERIOCINA e inibisce L.p. A. lwoffii  non produce alcuna sostanza e promuove L.p. Messi P, Bondi M, Marchesi I, Borella P, Guerrieri E. “Role of direct bacterial interference and biofilm in Legionella pneumophila water ecology” Atti del 20th Annual Meeting of EWGLI, 2005

24. Modalità di infezione Per inalazione di aerosol contaminati Per aspirazione di acqua contaminata Per inalazione di particelle di polvere da essi derivate per essiccamento Non si contrae bevendo acqua contaminata La trasmissione interumana non è stata dimostrata

25. Modalità di infezione La legionellosi si contrae generalmente via respiratoria mediante inalazione o microaspirazione di aerosol contaminato L’aerosol si forma attraverso le goccioline generate dagli spruzzi d’acqua o dall’impatto dell’acqua sulle superfici Più le goccioline sono piccole (< 5 micron) più facilmente raggiungono le basse vie respiratorie

26. Fattori di rischio per l’infezione • ESPOSIZIONE: tipo e intensità: carica batterica, grado di aerosolizzazione dell’acqua, vicinanza alla sorgente di aerosol • VIRULENZA DEL CEPPO: diversa capacità di sopravvivere e moltiplicarsi nei serbatoi ambientali ed umani (macrofagi) • SUSCETTIBILITA’ INDIVIDUALE: anziani, fumatori, soggetti con malattie croniche, immunocompromessi e con prolungata degenza ospedaliera

27. Fattori di rischio per infezione Sesso M:F = 2-3:1 Età media =55 aa, il 60% dei pazienti ha più di 50 aa Rara nei bambini, poco frequente nei giovani adulti Il 40% dei soggetti ha patologie croniche concomitanti

28. Rapporto infetti/malati Essendo un microrganismo opportunista, la maggior parte degli individui sani supera l’infezione senza manifestare sintomi di malattia conclamata, ma i meccanismi di protezione e/o suscettibilità non sono conosciuti

29. Origine dei casi • I primi casi di legionellosi sono stati ricondotti ad aerosol provenienti da impianti di climatizzazione • Le infezioni più recenti sono state causate da contaminazione di: • impianti di distribuzione dell’acqua (docce, • rubinetti, fontane, impianti termali, idromassaggi) • apparecchi per aerosol, ossigenoterapia e per la respirazione assistita • Numerosi clusters epidemici vengono segnalati per la diffusione di aerosol contaminati da torri di raffreddamento di grandi edifici • Segnalati casi acquisiti attraverso ferite • Segnalato un caso in un bambino a seguito del parto in acqua

30. I quadri clinici La Malattia dei Legionari è la forma più severa dell’infezione Si presenta come una polmonite acuta purulenta difficilmente distinguibile da altre forme di infezioni respiratorie acute delle basse vie aeree La Febbre di Pontiacè una manifestazione acuta simil-influenzale che non interessa il polmone

31. Malattia dei Legionari • Incubazione da 2 a 10 giorni (forse fino a 15gg) • Prodromi (malessere, mialgie e cefalea) cui segue febbre alta, tosse non produttiva, sintomi comuni ad altre forme di polmonite • Possono essere presenti sintomi extrapolmonari utili ad indirizzare la diagnosi, quali manifestazioni neurologiche, renali e digestive • Il reperto radiologico toracico non è patognomonico • La diagnosi definitiva può essere raggiunta • solo con indagini di laboratorio

32. DIAGNOSI Isolamento colturale(escreato, sangue, BAL, tessuti post-mortem) con terreni di coltura selettivi e tempi di crescita lunghi (4-10 giorni) Ricerca dell’antigene solubile nelle urine di L. pneumophila sierogruppi 1-14 Sieroconversione (almeno 10gg) Immunofluorescenza diretta PCR

33. Alcune osservazioni L’aumentata consapevolezza della malattia fra i medici e l’uso dei test per la ricerca dell’antigene urinario ha incrementato la individuazione dei casi sostenuti da L.pneumophila Il gold standard resta tuttavia l’isolamento colturale che consente: a) di riconoscere tutte le infezioni b) di risalire alle fonti ambientali, attraverso l’analisi molecolare dei ceppi clinici ed ambientali isolati

34. Terapia I macrolidi quali claritromicina e azitromicina o i fluorchinolonici (levofloxacina) sono i farmaci più idonei per la loro capacità di concentrarsi nei macrofagi e nei tessuti polmonari La loro associazione è particolarmente utile nei pazienti fortemente immunocompromessi La terapia deve essere prolungata per almeno 3 settimane

35. Antibiotico resistenza Antibiotici quali la eritromicina, fluorchinolonici e rifampicina possono non risolvere la malattia, ma non sono segnalati fenomeni di resistenza negli isolati clinici di L. pneumophila. Dalle indagini sperimentali tutti i ceppi saggiati (ambientali e clinici) sono risultati sensibili ai farmaci di elezione. La mancanza della fase di colonizzazione prima dell’infezione (manca il portatore) minimizza il rischio di resistenza alle Legionellaceae in ambiente ospedaliero. Manca la pressione selettiva nell’ambiente naturale del microrganismo che è rappresentato dall’acqua contaminata. La possibilità di comparsa di resistenze suggerisce tuttavia di testare la sensibilità delle legionelle agli antibiotici che si intendono utilizzare per la terapia.

36. Altre forme di legionellosi • Febbre di Pontiac • La Febbre di Pontiac è una manifestazione acuta simil-influenzale che si risolve in 2-5 giorni, con tosse nel 30-60% dei casi e dolore toracico in assenza di interessamento polmonare. Si pensa sia dovuta ad una reazione ad antigeni batterici inalati, piuttosto che ad una vera e propria infezione. • Incubazione 24-48 ore • Forme subcliniche • Il frequente riscontro di anticorpi anti-Legionella spp ( 15% nella popolazione generale, dati personali) in assenza di episodi di polmonite fa ritenere che la legionellosi si possa manifestare come forma subclinica

37. Definizione di caso • Caso accertato • infezione respiratoria con E.O. positivo per polmonite focale e/o esame radiologico suggestivo di interessamento polmonare,accompagnato da 1 o più dei seguenti criteri: • isolamento di Legionella da materiale organico (secrezioni, tessuto polmonare, liquido pleurico o sangue) • aumento di almeno 4 volte del titolo anticorpale verso L. pneumophila sierogruppo 1 tra 2 sieri prelevati a distanza di almeno 10 giorni • riconoscimento dell’antigene specifico solubile nelle urine

38. Definizione di caso • Caso presunto • infezione respiratoria con E.O. positivo per polmonite focale e/o esame radiologico suggestivo di interessamento polmonare, accompagnato da 1 o più dei seguenti criteri: • aumento di almeno 4 volte del titolo anticorpale relativo a sierogruppi o specie diverse da L. pneumophila sierogruppo 1 • positività all’immunofluorescenza diretta effettuata su materiale patologico • singolo titolo anticorpale elevato (1:256) verso L. pneumophila sierogruppo 1

39. Definizione di Caso nosocomiale Caso confermato da test di laboratorio, in cui il paziente è stato ricoverato continuativamente in ospedale per almeno 10 giorni prima dell’esordio della malattia Se il periodo di ospedalizzazione è compreso fra 2 e 9 giorni, il caso è considerato di possibile eziologia nosocomiale Se 2 o più casi si verificano nello stesso ospedale nell’arco di 6 mesi, vengono considerati una epidemia ospedaliera Linee Guida nazionali

40. Classificazione dei casi 1 - Casi nosocomiali • 1999 Europa 9% • 2004 Italia 16,0% • Rappresentano una % limitata dei casi notificati, ma hanno letalità più elevata (circa 22-30% vs 10% nei casi comunitari) • 2 - Casi associati ai viaggi • 1999 Europa 21% (15% associati a viaggi all’estero) • 2004 Italia 13,6% • 3 - Altri Casi comunitari • 1999 Europa 70% • 2004 Italia 70,4% • Per la maggior parte di questi non è possibile risalire alla sorgente di infezione

41. Caratteristiche epidemiologiche delle legionellosi L’incidenza reale delle legionellosi nella popolazione è sconosciuta: nonostante l’aumento delle segnalazioni, l’incidenza dei casi notificati resta bassa Casi attesi (stima): 1-5% di tutti i casi di polmoniti comunitarie 3-20% di tutte le polmoniti nosocomiali Sulla base di queste indicazioni in Italia i casi incidenti potrebbero essere 1.000-10.000/anno

42. Motivi della sottostima la diagnosi etiologica delle polmoniti non è generalmente richiesta la diagnosi di legionellosi richiede test specifici non effettuati di routine i medici non sono sempre allertati

43. Motivi di preoccupazione Aumento nella popolazione delle persone a rischio Aumento negli ospedali di pazienti e procedure a rischio Difficoltà ad eradicare Legionella dai serbatoi contaminati Mancanza di metodi ottimali per prevenire la legionellosi

44. Aspetti critici della legionellosi A) difficoltà nella identificazione dei casi e nella ricerca delle fonti ambientali B) insufficiente conoscenza sulla reale prevalenza della infezione/malattia C) poche informazioni sui fattori di rischio coinvolti nella infezione/malattia e nessuna sulla predisposizione genetica D) limitate conoscenze sugli eventi molecolari e biochimici che permettono la sopravvivenza/moltiplicazione di Legionella nelle cellule umane e nei reservoirs ambientali E) difficoltà a controllare/eradicare Legionella spp applicando metodi di disinfezione efficaci