Genética molecular

1. Genética molecular • Cuenta de correo de la asignatura • genmol@gmail.com • email: dhgrasso@yahoo.com/dgrasso@cnia.inta.gov.ar

2. 2 evaluaciones, 2 fechas de cada uno: • Son equivalentes!, no hay distinción entre las fechas • Se puede utilizar ambas fechas para mejorar la nota 1 evaluación parcial de TPs Régimen de promoción tal como lo establece la Universidad ! al menos 6 en cada evaluación y el promedio de ambas debe dar al menos 7

4. Bases moleculares de la Herencia Las primeras preguntas de la herencia Aristóteles (384-322 AC) Ambos padres contribuyen a la creación de los hijos a través de la mezcla de sangres o humores. • Herencia mezcladora: • mezcla de caracteres de los padres en cada generación • explica que los miembros de una especie se parezcan Kirk y Michael Douglas

5. Las reglas de la herencia Analiza la herencia de características simples en arvejas La herencia se debe a elementos discretosque no se mezclan y aparecen en proporcionesestables y repetibles 1865 Gregor Mendel

6. 1869 Friedrich Miescher 1881 Albrecht Kossel 1905-1939 Phoebus Levene Estudia células blancas presentes en pus de vendas de heridas abiertas. • Obtiene un precipitado de núcleos, del que aisla una sustancia rica en fósforo que llamó nucleína • Esta sustancia se aisla de distintos tipos de células • Está compuesta por H N C y O • La nucleína contiene proteínas y porciones no proteicas (ácidos nucleicos). • Los ácidos nucleicos se pueden descomponer en azúcares y compuestos ricos en nitrógeno (purinas y pirimidinas). Diferencias entre ARN y ADN Estructura de los nucleótidos Enlaces entre nucleótidos

7. ¿ Qué evidencias experimentales indican que los ácidos nucleicos están asociados a la información genética?

8. 1928: Frederick Griffith Infección con pneumococos rugosas Lisas virulentas Las Primeras evidencias

10. El ADN como principio transformante Avery, MacLeod & McCarty(1944)

12. Alfred Hershey y Martha Chase (1952) Determinaron que el ADN es el material genético en el bacteriófago T2

13. La naturaleza química de los ácidos nucleicos

14. Cuando se realiza la hidrólisis completa de los ácidos nucleicos, se obtienen tres tipos de componentes principales: • Azúcar, en concreto una pentosa. • Ácido fosfórico • Bases nitrogenadas: púricas y pirimidínicas

15. Además de las bases nitrogenadas anteriormente descritas, se han encontrado otras bases nitrogenadas en algunos virus o formando parte de algunos tipos especiales de ARNs. • Ejemplos de algunas de estas bases púricas poco corrientes son: • Hipoxantina, • Xantina, • 2-metiladenina, • 6-metil-aminopurina. • Entre las bases pirimidínicas podríamos citar la • 5-metilcitosina (propia del ADN) y la 5-hidroximetil citosina (HMC) que sustituye a la citosina en los fagos T-pares. • En los ARN de transferencia (ARN-t) se encuentran • la Ribotimidina, • Dihidrouridina, • Seudouridina e • Inosina (I).

18. Algunas bases pueden ionizarse a bajo o alto pH Adenosina pKa = 3.8 Citidina pKa = 4.5 Guanosina pKa = 2.4 Guanosina pKa = 9.4 Las bases están sujetas a tautomerización

19. La estructura del ADN

20. REGLAS DE CHARGAFF PARA ADN DE DOBLE HÉLICE • La proporción de Adenina (A) es igual a la de Timina (T). A = T . La relación entre Adenina y Timina es igual a la unidad (A/T = 1). • La proporción de Guanina (G) es igual a la de Citosina (C). G= C. La relación entre Guanina y Citosina es igual a la unidad ( G/C=1). • La proporción de bases púricas (A+G) es igual a la de las bases pirimidínicas (T+C). (A+G) = (T + C). La relación entre (A+G) y (T+C) es igual a la unidad (A+G)/(T+C)=1. • Sin embargo, la proporción entre (A+T) y (G+C) era característica de cada organismo, pudiendo tomar por tanto, diferentes valores según la especie estudiada. Este resultado indicaba que los ácidos nucleicos no eran la repetición monótona de un tetranucleótido. Existía variabilidad en la composición de bases nitrogenadas

25. A T G C 2 Cadenas enrolladas sobre el mismo eje formando una doble hélice a la derecha • El esqueleto hidrofìlico de grupos fosfato y deoxiribosa alternantes está expuesto al agua del ambiente • El anillo de furanosa está en la conformación C-2´endo • Las bases están apiladas en el interior de la doble helice, con sus planos perpendiculares al eje de la doble hélice • El apareamiento de las dos cadenas genera un surco mayor y un surco menor en la superficie de la doble hèlice

27. Fuerzas que estabilizan la doble hélice • Enlaces de hidrógeno (pequeña contribuión) • Apilamiento de bases e interacción hidrofóbica • Interacciones iónicas: • Repulsión entre las cargas negativas de los fosfatos • Los cationes actúan como contraiones estabilizando el ADN • (divalentes mas eficientes que monovalentes; el Mg+2 estabiliza la • estructura del RNA

28. ADN-B: ADN en disolución, 92% de humedad relativa, se encuentra en soluciones con baja fuerza iónica se corresponde con el modelo de la Doble Hélice.  ADN-A: ADN con 75% de humedad, requiere Na, K o Cs como contraiones, presenta 11 pares de bases por giro completo y 26 A de diámetro. Es interesante por presentar una estructura parecida a la de los híbridos ADN-ARN y a las regiones de autoapareamiento ARN-ARN. ADN-Z: doble hélice sinistrosa (enrollamiento a izquierda), 12 pares de bases por giro completo, 18 A de diámetro, se observa en segmentos de ADN con secuencia alternante de bases púricas y pirimidínicas (GCGCGC), debido a la conformación alternante de los residuos azúcar-fosfato sigue un curso en zig-zag. Requiere una concentración de cationes superior a la del ADN-B, y teniendo en cuenta que las proteínas que interaccionan con el ADN tienen gran cantidad de residuos básicos sería posible que algunas convirtieran segmentos de ADN-B en ADN-Z.

29. La estructura del híbrido DNA-RNA es la de una doble hélice con las características generales de un A-RNA, o del A’-RNA. Típicamente se detectan 11-12 pares de bases por vuelta de hélice.

30. Agentes intercalantes Acridine orange Ethydium bromide • Moléculas aromáticas que interaccionan con el ADN insertándose entre bases apiladas • Fluorescentes • Detección de DNA y RNA • Agentes mutagénicos

31. ADN triple hélice o ADN-H: "In vitro" es posible obtener tramos de triple hélice intercalando oligonucleótidos cortos constituidos solamente por pirimidinas (timinas y citosinas) en el surco mayor de una doble hélice. Este oligonucleótido se une a pares de bases A-T y G-C mediante enlaces de hidrógeno tipo Hoogsteen que se establecen entre la T o la C del oligonucleótido y los pares A-T y G-C de la doble hélice. No se sabe la función biológica del ADN-H aunque se ha detectado en cromosomas eucarióticos. Apareamiento tipo Hoogsteen Estables a pH bajos (C+,pKa= 7.5)

32. ADN cuadruplexo: "In vitro" se han obtenido cuartetos de Guanina (ADN cuadruplexo) unidas mediante enlaces tipo Hoogsteen, empleando polinucleótidos que solamente contienen Guanina (G). Los extremos de los cromosomas eucarióticos (telómeros) tienen una estructura especial con un extremo 3' OH de cadena sencilla (monocatenario) en el que se repite muchas veces en tandem  una secuencia rica en Guaninas. Se piensa que el ADN cuadruplexo telomérico serviría para proteger los extremos cromosómicos de la degradación enzimática. Ejemplo de secuencia telomérica rica en guaninas (G): 5´P  TTGGGTTGGGGTTGGGG...............TTGGGG  3'OH

33. DENSIDAD DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS Densidad: existe una relación lineal entre el contenido en G+C y la densidad del ADN determinada en un gradiente de densidad. A mayor contenido en G+C mayor densidad posee el ADN. Basándose en múltiples estudios de la densidad de los ADNs de diferentes organismos y de su composición en bases nitrogenadas, se ha establecido una fórmula empírica que relaciona la densidad de flotación (r) con el contenido en G+C expresado en moles por ciento. Está fórmula es la siguiente: ρ = 1,660 + 0,00098(G+C).

34. Desnaturalización del ADN ¿Qué es? ¿Cómo la ponemos de manifiesto? ¿Qué agentes desnaturalizantes existen? ¿cómo actúan?

35. Fuerza iónica • Agentes caotrópicos • Agentes formadores de puentes de hidrógeno

36. Para DNA:DNA duplex: Tm = 81.5o + 16.6 log M + 41 (fraccion molar G+C) - 500/L -0.62 (%formamida) • Para oligonucleotidos (menores a 20 nt en 0.9M NaCl) Td(oC) = 4 (G + C) + 2 (A + T) For probes >150 ,Tm decreases 1o for every 1% mismatch.For oligonucleotides Td decreases 5o for every mismatch.

37. La hibridación de ANs posee múltiples usos • Southern blot /Northern blot • Colony bloting • PCR • Purificación • Microarrays • FISH

40. Condiciones que favorecen la desnaturalización • Alta temperatura • Baja fuerza iónica (repulsión de fosfatos) • Alto pH (desprotonación de bases) Monitoreo de la desnaturalización • Los enlaces conjugados de las bases generan absorción en el UV a 260nm Nucleótidos libres> ssADN> dsADN • La temperatura a la cual la A260 alcanza la mitad de su valor máximo es denominada Tm • La Tm depende de la concentración salina, pH, composición, longitud • La condición standard es 0.12 M buffer fosfato de sodio (0.18 M en ion sodio

41. DESNATURALIZACION POR CALOR • Oligonucleótidos cortos • Tm = (A+T)x2oC + (C+G)x4oC • Oligonucleótidos largos • Tm = 81.5 +16.6Log [Na+]+ • +0.41 (%CG) – 625/N • N –length of oligo

42. Hidrólisis de ácidos nucleicos • Ruptura de enlaces en el esqueleto polinucleotídico • Hidrólisis ácida (1 mM HCl): ruptura del enlace glicosídico entre purinas y desoxiribosa (producto: ac. apurínico • Hidrólisis alcalina (RNA)– clivaje del enlace fosfodiester

43. Renaturalización • La desnaturalización es un proceso reversible • Reanealing – reasociación de las cadenas de ADN

44. Cinética de renaturalización La reasociación de ADN no repetido se produce en un rango de 2-log

45. Definición de Cot1/2: función inversa de la constante de velocidad (k) C0t ½ :valor de Cot cuando se reasoció un 50%

47. ¿Complejidad del Genoma ? ¿Qué es? AAAAAAAAAAAAAAAA C= 1; L=16 ATATATATATATATATA C= 2; L=16 ATCATCATCATCATCA C= 3; L=16 C= 16; L=16 ATCGCTAGAACGTCTG

48. Curvas de reasociación de ADN no repetitivo(fragmentos de 500 nt) (N) C = N ≈ 10,000 genes 200 genes ≈ 4,000 genes C0t1/2 3 genes 106 repeats If no repeated sequences: C = to genome size (nt-bp) N (genome size) is determined directly from C0t1/2

49. Reasociación para Eucariotes ≈ 20-25% altamente repetitivo: 2x106 copias ≈ 25-30% Moderadamente Repetitivo 350 copias ≈ 45-55% Copia única > 2 logs: diferentes poblaciones

50. Leer del Lodish!!!! • ¿Qué representan las secuencias únicas, moderadamente repetidas y altamente repetidas???