G énmanipuláció ecetmuslicában: P elem technikák

1. Génmanipuláció ecetmuslicában: P elem technikák A P elemek mobilitásának szabályozása

2. A P elemek mobilitásának szabályozása Két szabályozási állapot létezik: az M és a P citotípusnak megfelelő. - kromoszómális és extra-kromoszómális faktorok P citotípusú állatokban a P elemek transzkripciósan szupresszált állapotban vannak: - transzkripciós szabályozás? - poszt-transzkripciós szabályozás? A szabályozási mechanizmus anyai hatást és anyai öröklődést mutat. A P elemek mobilitásának szabályozásában szerepe van az inszerciók genomikus pozícióinak is. A P elemek mobilitása szövetspecifikus. A szabályozási mechanizmus részletei nem ismertek.

3. P elem függő hibrid diszgenezis Nőstény szülő P M normális normális M M M citotípusú P citotípusú Hím szülő normális diszgenikus P M citotípusú P citotípusú Csak M és P törzsek közötti keresztezés okoz hibrid diszgenezist, de csak akkor, ha a hím származik a P törzsből

4. snw snw + snw sne sn+ A snw genetikai esszé a transzpozáz aktivitás kimutatására X snw Tesztelő törzs X :

5. DS: 2.2 % DS: 99.8 % X X G0 X X G1 DS: 99.5 % DS: 3.9 % DS: 4.2 % DS: 40.4 % G2 DS: 2.2 % DS: 2.4 % A P citotípus meghatározásában kromoszómális és extra-kromoszómális faktorok is szerepet játszanak P citotípusú anyai öröklődés M citotípusú anyai öröklődés Pre-P DS: diszgenikus sterilitás

6. ORF 1 ORF 3 IR ORF 2 IR ORF 0 A P elem mobilitás szövetspecifitását alternatív RNS splicing biztosítja ATG TAA TGA UAA AUG AAAA ivarsejt mRNS 87 kD transzpozáz AUG UGA AAAA szomatikus mRNS 66 kD represszor UAA AUG belső deléció AAAA deléciós mRNS 24 kD represszor

7. A P elemek mobilitásának szabályozása Két szabályozási állapot létezik: az M és a P citotípusnak megfelelő. - kromoszómális és extra-kromoszómális faktorok P citotípusú állatokban a P elemek transzkripciósan szupresszált állapotban vannak: - transzkripciós szabályozás? - poszt-transzkripciós szabályozás? A szabályozási mechanizmus anyai hatást és anyai öröklődést mutat. A P elemek mobilitásának szabályozásában szerepe van az inszerciók genomikus pozícióinak is. A P elemek mobilitása szövetspecifikus. A szabályozási mechanizmus részletei nem ismertek.

8. 66kD P elem transzpozíció gátlásának molekuláris mechanizmusai Transzkripciós Poszt-transzkripciós Tnp 66kD 66kD aktív Tnp inaktív Tnp

9. A P elemek mobilitásának szabályozása Két szabályozási állapot létezik: az M és a P citotípusnak megfelelő. - kromoszómális és extra-kromoszómális faktorok P citotípusú állatokban a P elemek transzkripciósan szupresszált állapotban vannak: - transzkripciós szabályozás? - poszt-transzkripciós szabályozás? A szabályozási mechanizmus anyai hatást és anyai öröklődést mutat. A P elemek mobilitásának szabályozásában szerepe van az inszerciók genomikus pozícióinak is. A P elemek mobilitása szövetspecifikus. A szabályozási mechanizmus részletei nem ismertek.

10. dajkasejtek petesejt follikuláris sejtek A 66kDa represszor szerepe a P citotípus kialakításában P elemek olyan genomikus régióba inszertálódnak, amelyek expresszálódnak az oogenezis folyamán. A 66 kDa represszor fehérje termelődik a dajka és follikuláris sejtekben az oogenezis folyamán. A petesejt felhalmozza a 66 kDa represszor fehérjét, ami gátolja a transzpozáz képződését és aktivitását. A 66 kDa represszor fehérje jelenléte biztosítja a P citotípus anyai hatását és anyai öröklődését.

11. A P elemek mobilitásának szabályozása Két szabályozási állapot létezik: az M és a P citotípusnak megfelelő. A szabályozási mechanizmus anyai hatást és anyai öröklődést mutat. - kromoszómális és extra-kromoszómális faktorok P citotípusú állatokban a P elemek transzkripciósan szupresszált állapotban vannak: - transzkripciós szabályozás? - poszt-transzkripciós szabályozás? A szabályozási mechanizmus anyai hatást és anyai öröklődést mutat. A P elemek mobilitásának szabályozásában szerepe van az inszerciók genomikus pozícióinak is. A P elemek mobilitása szövetspecifikus. A szabályozási mechanizmus részletei nem ismertek.

12. P elem transzpozíció gátlásának „trans-silencing” modellje X Riporter P elem inszerció P elem inszerció TAS szekvencákban Csökkent riporter expresszió

13. Génmanipuláció ecetmuslicában: P elem technikák A P elem technikák: mutagenezis I.

14. A P elem mutagenezis • Először P citotípusú P törzsekkel és vad típusú P elemekkel • Mutációk nem stabilak • A mutánsok több inszerciót is hordoznak • Körülményes a mutációk térképezése, és az érintett gének klónozása • Mutagenezis egyetlen P elem felhasználásával • A mutagenezis egy-egy speciális P elemet hordozó nőstény és hím keresztezése során játszódik le. • Mutátor elemek (nem autonóm) • Jumpstarter elemek (nem autonóm) • Mutáns vonalak egyetlen random mutátor inszerciót hordoznak. • Az érintett gének könnyen azonosíthatók és klónozhatók.

15. lacZ mini-white ori amp E B A P-lacW mutátor elem felépítése Bakteriális szekvencia a DNS klónozást teszi lehetővé Génexpresszió követését teszi lehetővé Marker gén lehetővé teszi a P elem követését

16. EcoRI EcoRI EcoRI EcoRI A gén B gén C gén A gén ori amp P elemmel jelölt gének klónozása plazmid menekítési kísérletben P elem inszerciósmutáns izolálása Genomikus DNS EcoRI emésztése majd ligálása menekítő plazmid baktérium transzformáció és antibiotikum szelekció plazmid DNS izolálása és befogott gének azonosítása

17. P(w+) P(w+) P(w+) P(w+) W- Y Domináns P elem inszerciós mutánsok izolálása mutátor törzs transzpozáz forrás P(Δ2-3), Sb W- X Y TM6, Tb P(w+) P(Δ2-3), Sb W- W- X W- Y „jump-starter” hímek W- vagy Y w- hímek szűrése domináns fenotípusra

18. P(w+) P(w+) P(w+) W- W- Y Y Recesszív P elem inszerciós mutánsok izolálása Sco W- X W- SM5 F2 az előző keresztezésből W- X W- SM5 SM5 Szűrés recesszív látható, vagy letális mutációra