1 / 20

Biol 3030 – Lab Desarrollo JA Cardé

Biol 3030 – Lab Desarrollo JA Cardé. Objetivos. -Biotecnología -Subcloning -Vectores 3 Modulos Ligación : fragmento + vector Transformacion de E coli Selección por resistencia, crecimiento y ensayo de transfomantes Opcional ; Extraccion de DNA Plasmido El Vector: pUC8, 2700pb

dandre
Télécharger la présentation

Biol 3030 – Lab Desarrollo JA Cardé

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. Biol 3030 – Lab Desarrollo JA Cardé

  2. Objetivos

  3. -Biotecnología • -Subcloning • -Vectores • 3 Modulos • Ligación : fragmento + vector • Transformacion de E coli • Selección por resistencia, crecimiento y ensayo de transfomantes • Opcional ; Extraccion de DNA Plasmido • El Vector: • pUC8, 2700pb • Sitio para Eco R1 en M13 mp en el fragmento de LacZ

  4. pUC8 – 2665 bp Contiene parte del gen lac Z Codifica para ß galactosidasa Metabolismo de galactosidos Operon de lactosa α fragment del gene de lacZ

  5. E coli mutada en lac Z • Su cromosoma tiene el fragmento Ω de lac Z • Cuando α y Ω interactuen lac Z sera funcional • α complementation • Operon de lac • Represores (lac) • Activadores (CAP+ cAMP) • Inductores (IPTG) atrapan al represor • Sustratos para ß galactosidasa • Lactosa • X-Gal, hidrolizado se pone azul • PLT transformantes con pUC donde lacZ sea funcional seran azules! • ONPG – sustrato para ßgal pero amarillo espectrofoto

  6. MCR/MCS MCS insertado dentro del lac Z gene pero no interfiere Insertos caeran en el MCS y si interrumpen el lac Z gene PLT transformantes con el inserto seran color no azul… blancas

  7. Ligacion: Vector linearizado T4 DNA ligasa Fragmentos de DNA Mg+2 Enlace fosfodiester 5’-3’ 37 C vs 4-22 C

  8. Recircularizacion • Concatamerizacion • AlkPhosph • Orientacion de la ligacion • Transformacion • Celulascompetentes (JM109) • No resistencia • No plasmids • No enzimas de restriccion

  9. Eficiencia de la transformacion • -supercoiled > circular > lineal • 10 ngs es suficiente • 100 ngs inhibe • 1/10000 celulas se transforma • Se define 3 de transformantes por µg de DNA • 10 ng para 1ml de celulas • Salen 100 colonias = 1000 transformantes/ml • 1000transf/0.01ug = 1x10^5 • Screening Blue/White • Resistencia ayuda a seleccionar (Amp) • Pero de las que crecen cuantas tienen el gen? • Azules vs Blancas • Azules lacZ+ ONPG amarillo • Blancas lacZ- ONPG no

  10. Study Questions

  11. Resultados • Recuerde discutir los resultados objetivo por objetivo. • Cada objetivo tiene una pregunta de investigación, una hipótesis, alguna tabla o figura que los resume y su discusión y conclusión. • Al final una conclusión general de todo el ejercicio.

More Related