CITÓMETRO DE FLUJO UF-1000i

1. CITÓMETRO DE FLUJOUF-1000i Raúl Gil Orts R2 Análisis Clínicos

2. INTRODUCCIÓN • Principios • Citometría de flujo - ¿Qué podemos analizar? - ¿Qué parámetros? - ¿Cómo funciona? • UF-1000i • Análisis de las células de orina • Interpretación de los resultados

3. PRINCIPIOS - Emplea la citometría de flujo para analizar los elementos contenidos en la orina - Discrimina y clasifica en función del grado de fluorescencia y dispersión de la luz

4. CITOMETRIA DE FLUJO Es un método analítico por el que se mide la emisión de múltiples fluorescencias y la dispersión de luz de células o partículas microscópicas, alineadas secuencialmente mediante una corriente líquida laminar, cuando son presentadas de una en una y a gran velocidad frente a un haz de luz láser de longitud de onda adecuada

5. CITOMETRÍA DE FLUJO:´¿QUÉ PODEMOS ANALIZAR? Nivel molecular Proteínas extracelulares Secuenciasde ADN o ARN libres Complejos inmunes circulantes Nivel Subcelular Viriones individuales Liposomas Cromosomas aislados Orgánulos aislados Núcleos aislados Nivel Celular Bacterias Hongos unicelulares Células humanas y animales Protoplastos vegetales Nivel supracelular Hibridomas y fusiones celulares Esferoides Organismos pluricelulares

6. CITOMETRÍA DE FLUJO:¿QUÉ PARAMETROS PODEMOS ANALIZAR? Parámetros nucleares Parámetros citoplasmáticos: Proteínas Enzimas Parámetros extracelulares: Proteínas secretadas Parámetros de superficie: Moléculas de superficie Pared celular

7. CITÓMETRO DE FLUJO UF-1000i:¿CÓMO FUNCIONA? Fluido células en suspensión Reactivo envolvente Reactivo envolvente Análisis Señal óptica: Luz dispersa Luz Fluorescente DIAGRAMAS DISPERSIÓN HISTOGRAMAS

8. CITÓMETRO DE FLUJO UF-1000i:PARTES • Unidad principal • Muestreador • Unidad de proceso • de la información

9. Sistema óptico SISTEMA DE LUZ FLUORESCENTE LATERAL SISTEMA DE LUZ DISPERSA LATERAL SISTEMA DE LUZ DISPERSA FRONTAL

10. FLUJO DEL REACTIVO ENVOLVENTE SE INTRODUCIE UN FLUIDO ENVOLVENTE PRESURIZADO - FORMA UN TÚNEL LÍQUIDO PERMITE LA ENTRADA DE LAS CÉLULAS - DE UNA EN UNA - EVITA LA FORMACIÓN DE COÁGULOS • ESTOS 2 FLUIDOS NO SE MEZCLAN • MEJORA LA PRECISIÓN Y LA REPRODUCIBILIDAD DEL RECUENTO • - IMPIDE LA CONTAMINACIÓN DE LA CÉLULA DE FLUJO

11. FLUJO DEL REACTIVO ENVOLVENTE Evitar

12. SISTEMA ELECTRICO UNIDAD PRINCIPAL HISTOGRAMA ERITROCITOS LEUCOCITOS LUZ DISPERSA FRONTAL LUZ FLUORESCENTE UNIDAD DE PROCESAMIENTO LUZ DISPERSA FRONTAL LUZ DISPERSA LATERAL LUZ FLUORESCENTE DIAGRAMA DE DISPERSIÓN

13. ANÁLISIS DE LAS CÉLULAS DE ORINA Principios del análisis Formas de onda • Información • - tamaños celulares • Estado superficie • -características tinción Análisis -altura - amplitud - inclusiones - otros factores célula Clasificacion de las células

14. ANÁLISIS DE LAS CÉLULAS DE ORINA SEÑAL DE LA LUZ DISPERSA LATERAL La señal de la luz refleja el estado de la superficie de las células Refleja la intensidad y la longitud de la tinción del núcleo citoplasma membranas bacterias SEÑAL DE LA LUZ FLUORESCENTE SEÑAL DE LA LUZ DISPERSA FRONTAL La señal de la luz dispersa frontal refleja la información sobre el tamaño de las partículas

15. Parámetros Parámetros de análisis (Elementos formados) RBC: Eritrocito WBC: Leucocito EC: Célula epitelial CAST: Cilindro BACT: Bacteria Parámetros de aviso y estudio (elementos cuantitativos) X´TAL: Cristal YLC: Célula levaduriforme SRC: Célula redonda pequeña Path. CAST: Cilindro patológico MUCUS: Mucosidad SPERM: Espermatozoides Cond.: Conductividad

16. Diagramas dispersión

17. Diagramas de dispersión

18. Patrones de histogramas La intensidad de la luz dispersa frontal y de la luz fluorescente se combinan con el número de células de la orina clasificadas

19. Interpretación de resultados • RBC • Generalmente no se requiere comprobar el recuento con microscopia manual • En caso de discrepancia con la tira: verificar si densidad o la conductividad son bajas. Posible lisis • - Interferencias de X´TAL contados como RBC: verificar diagrama dispersión. • Comprobar si UF ha mostrado alarma de baja fiabilidad RBC/X´TAL • - Interferencias de YLC clasificadas como RBC: verificar diagrama dispersión. Comprobar si UF ha mostrado alarma de baja fiabilidad RBC/YLC • - Cut-off: 25 RBC/microL • WBC: • Generalmente no se requiere comprobar el recuento con microscopia manual • En caso de discrepancia con la tira: verificar si densidad o la conductividad son bajas. Posible lisis • En recuentos elevados se pueden presentar fragmentos de WBC por lisis parcial que pueden clasificarse como BACT o YLC • Cut-off: 40 WBC/microL

20. Interpretación de resultados • EC/SRC • Recuento elevado de SRC: proceder a microscopía manual. • EC sin alarma de SRC, no provee valor diagnóstico y puede indicar baja calidad de la muestra, por ejemplo por contaminación. Da información sobre poca fiabilidad del recuento de BACT. • CAST/Path CAST • En caso de PRO elevadas en la tira sin alarma de CAST en el UF: revisar al microscopio • Los CAST hialinos pueden verse interferidos por el MUCUS • BACT • Recuentos son específicos del canal de BACT, sin embargo se pueden encontrar otras partículas que pueden ser fuente de interferencia: verificar el diagrama de dispersión • -Comprobar si UF ha mostrado alarma de baja fiabilidad • RBC/BACT.

21. Interpretación de resultados • YLC • Si se observan recuentos elevados en comparación con la microscopía: • verificar en el diagrama de dispersión la existencia de solapamiento con el área de RBC; verificar la excesiva extensión del área OTHERS. • X´TAL • En caso de posible interferencia con RBC, verificar el diagrama de dispersión.

22. GRACIAS