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Química Forense

Química Forense. Tema 7 Mg . Diego Santiago Rinaldi. La autopsia toxicológica. Es la investigación retrospectiva que permite determinar la presencia de sustancias tóxicas en el organismo.

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  1. Química Forense Tema 7 Mg. Diego Santiago Rinaldi

  2. La autopsia toxicológica

  3. Es la investigación retrospectiva que permite determinar la presencia de sustancias tóxicas en el organismo. • Asimismo investiga mediante procesos analíticos, químicos y físicos la presencia de lesiones producidas por sustancias tóxicas; si existe relación de causalidad entre el tóxico, los signos, las lesiones y la dosis de la sustancia hallada. AUTOPSIA TOXICOLÓGICA

  4. Forma parte de la investigación tanatológica permitiendo conocer: Causa de muerte Mecanismos de producción y fisiopatología del fallecimiento Diagnósticos diferenciales Veracidad o falsedad de las hipótesis planteadas en la investigación criminal relacionadas con el cadáver y la escena del crimen

  5. En caso de muerte por tóxicos En caso de muerte por otras causas Objetivo de la autopsia toxicológica DAR RESPUESTA A LOS PUNTOS DE PERICIA SOLICITADOS POR EL JUEZ (Si los hubiere)

  6. Que se busca? Que se puede esperar? Tiempos? • PLAGUICIDAS: Organofosforados, Órganoclorados, Carbamatos, Piretroides, Cumarinas, etc. • DROGAS DE ABUSO: Cocaína, THC, Morfina, Heroína, Anfetaminas, etc. • DROGAS QUE ACTÚAN SOBRE EL SNC: Anestésicos Aril-Aminicos Primarios, Barbitúricos, Benzodiacepinas, Tranquilizantes mayores (Halopidol, Nozinan, Ampliactil, entre otros), Ketamina, etc. • FÁRMACOS VARIOS: Anestésicos antipiréticos, Misoprostol, Diuréticos, Antihipertensivos, etc. • ALCOHOL ETÍLICO y otros Tóxicos Volátiles. • MONÓXIDO DE CARBONO y otros Tóxicos Gaseosos. • ARSÉNICO, MERCURIO y otros Tóxicos Minerales. Diagnóstico de Intoxicación

  7. Drogas Depresoras del SNC • En probables suicidios • En probables homicidios? • Antecedentes de tratamientos • Mala Praxis – Historia Clínica Alcohol • Grado de ebriedad y su correlación con lucidez y grado de responsabilidad • Asociaciones de sustancias. Sinergismo SUSTANCIAS QUE INTERESAN A LA CAUSA DE MUERTE SIN PROVOCAR MUERTE

  8. AGUDA : EXPOSICION DE CORTA DURACION CON ABSORCION RAPIDA DEL TOXICO. DOSIS UNICA O MULTIPLES EN CORTO TIEMPO. MUERTE O CURACION EN CORTO PLAZO. • SUBAGUDA: MOMENTO DE APARICION BRUSCO EN RELACION A LA ABSORCION DEL AGENTE. EXPOSICIONES FECUENTES EN UN PERIODO DE VARIOS DIAS O SEMANAS • CRONICA: EXPOSICION REPETIDA POR MUCHO T. MECANISMOS 1) ACUMULACION DEL TOXICO 2) LOS EFECTOS SE ADICIONAN SINNECESIDAD DE ACUMULACION (CANCERIGENOS) CABE MENCIONAR: • PROCESOS AGUDOS DENTRO DE LA I. CRONICA (DDT) • CUADROS CRONICOS POR DOSIS UNICA EJEMP. AZOBENCENOS DAN NECROSIS HEPATICA INTOXICACIONES SEGÚN RAPIDEZ DE APARICION, SEVERIDAD Y DURACION DE SINTOMAS:

  9. TOXICIDAD AGUDA DE UN AGENTE QUE SE ABSORBE POR CUALQUIER VIA (EXCEPTO RESP) .SE MIDE O CUANTFICA EN DOSIS EFECTIVA 50 ( SUST QUE PRODUCE EFECTOS) O DOSIS LETAL 50 ( +). • En intoxicación respiratoria se considera cc aire y T exposición TIPOS DE INTOXICACION • CRIMINAL CONOCIMIENTO PREVIO DE LAS PROPIEDADES DEL TOXICO? • ACCIDENTALES • ALIMENTICIAS • PICADURAS ANIMALES GASES • ABSORCION ACCIDENTAL ERRORES DE ROTULO • MEDICAMENTOSAS • VOLUNTARIA • AUTOLESION Y/O SUICIDIOS • DROGADICCION : INT. AGUDA,IMPUREZAS,SOBREDOSIS, ETC • TERAPEUTICA: EL SUJETO NO TIENE INTENCION DE SUICIDARSE SINO DE ALIVIAR DOLORES, TENSIONES, ETC Toxicidad

  10. Drogas de Abuso: Clasificación mixta, según efectos y naturaleza de la sustancia

  11. En el NEA DROGAS POPULARES: -Alcohol -Marihuana -Benzodiacepinas

  12. Alcohol etílico Como droga de abuso

  13. El consumo de bebidas alcohólicas o más específicamente el abuso de las mismas, se ha tornado en un problema de crecientes proporciones , tomando en cuenta las estadísticas de hechos como accidentes de tránsito, muertes violentas y criminalidad en los que alguno de los actores se encontraba bajo los efectos del alcohol. IMPORTANCIA DE SU DOSAJE

  14. La validez de esta prueba depende del proceso y manejo adecuado que se le dé a los especimenes de autopsia enviados a análisis, desde su obtención (estado del cuerpo, material de transporte, lugar de obtención de la muestra), cadena de custodia, hasta llevar el procesamiento final de la muestra.

  15. Enzimas capaces de biotransformar el etanol a acetaldehído: • - La alcohol deshidrogenasa (+ importante) • - La catalasa es también apta para efectuar dicha biotransformación (depende de los niveles de peróxidos, lo que no es usual en los hepatocitos). • -Sistema“Meos” esta localizada en la fracción microsomal, con un requerimiento en NADPH y oxígeno para darse la transformación señalada. • El próximo paso metabólico es la conversión a ácido acético mediante la acetaldehído deshidrogenasa y NAD+ • Luego en el Ciclo de Krebs el acetato formado pasa a dióxido de carbono o bien participa en la síntesis de ácidos grasos, esteroides o cuerpos cetónicos. Metabolismo del etanol

  16. Curva de Metabolización del etanol

  17. Es posible conocer la concentración del alcohol en sangre en un tiempo cero después de establecido el equilibrio de una dosis única de alcohol, lo que puede calcularse según la fórmula de Widmark: • C= A/ r p C: concentración de alcohol en sangre A: dosis de alcohol ingerida p : peso del sujeto r : coeficiente de reparto que relaciona la concentración de alcohol en los tejidos y la alcoholemia.

  18. Coeficientes de reparto

  19. Tipos de Muestras Toma de Muestra • Sangre: venosa femoral o de cavidades cardíacas • Orina • Humor vítreo • Hígado • Desinfectar con líquidos no alcohólicos. • Envase sin cámara de aire. • Refrigerar. • Anticoagular con fluoruro de sodio si es necesario. Laboratorio

  20. La producción endógena de etanol postmortem no ocurre en ningún tejido por lo menos a los 8 días de tomada la muestra, siempre y cuando la muestra sea almacenada bajo refrigeración en un rango entre los -20° C y los 4°

  21. Cualitativo: Microdifusión de Conway Cuantitativo: Cromatografía Gaseosa Métodos

  22. Períodos de Ebriedad

  23. Valoración médico legal de la alcoholemia

  24. Drogas de Abuso Confirmación y Cuantificación en el laboratorio

  25. Análisis Orientado Análisis de drogas desconocidas • Procedimientos de extracción y determinación específicos para una determinada sustancia. • Cuando los antecedentes del caso apuntan hacia la misma o si se quieren hacer determinaciones cuantitativas. • Esta modalidad implica realizar un “screening” para descartar el mayor número de tóxicos posibles e incluir un número reducido de ellos, hasta lograr la identificación, pudiendo posteriormente aplicar una técnica directa para aumentar la posibilidad de confirmarlo. Consideraciones previas

  26. Preparación de la muestra • Aislamiento del analito • Concentración del extracto. • Identificación del analito: - nivel primario -nivel secundario • Cuantificación Etapas

  27. CCD para grupos particulares • Anfetaminas:  Anfetamina, Efedrina, MDMA • Metanol:NH3 (100:1.5) • Sal fastblack K1% en H2O(fresco) • Vapores de NH3 • 2,4-dinitrofluorbenceno Identificación: nivel primario

  28. THC- Cannabinoles FM: Cloroformo : acetona ( 80:20) • Revelado: • Fast blue B  • Vapores de amoníaco • Morfina-Codeína- Heroína FM:Tolueno, Acetona, Metanol:NH3,22:22:4:2 Revelado • Luz UV 254nm • Dragendorff • Iodoplatinato

  29. Por cada 2 ml de orina se añaden 2 ml de KOH 1 M y 5 ml de agua, comprobar que el pH sea 11. • Se realizan 2 extracciones sucesivas con cloroformo o diclorometano. Se separa a través de sulfato de sodio anhidro y se reúnen los extractos y se añaden 50 ul de metanol ácido (CH3OH: HCl(c) 9:1) y se concentra, posteriormente se reconstituyen 50 ul de metanol. • Sílica gel G 60 F-254 nm, metanol: amoníaco e 100:1,5. • - Fast Black K 1% en agua, seguido de NaOH 1 M. • - Ninhidrina 10% en etanol y colocar 15 min a 120 ºC • - Reactivo de Simon. • - Fluorescamina 10 mg en 50 ml de acetona. • Los patrones de referencia de anfetamina, metanfetamina, etc se preparan a una concentración de 5 mg / ml y se aplican 1 ul de cada solución en cada placa. Determinación de anfetaminas y derivados en orina por CCD

  30. Por cada 5 ml de orina se le añaden 0,5 ml de HCl concentrado y se coloca 2 horas a 120 °C. • Se realizan dos extracciones con 2 ml de cloroformo cada una. • Se concentra. Se aplican 20 ul en placas de sílica Gel G 60 F-254 nm de n Cloroformo : Acetona 9:1. • Los patrones de referencia se preparan a una concentración de 0,1 mg / ml en HCl 1 M, principales metabolitos ya benzofenona. • Revelado • uv • AcTricloroacetico • 4 amino cinamaldehido Determinación de BZD en orina por CCD

  31. Cuantificación del analito Una vez identificado el analito la cuantificación del mismo se puede realizar por una técnica directa, bien ajustada y utilizando patrones de referencia puros para análisis. (GC-MS, HPLC-MS).

  32. C. de reparto: separa los solutos basándose en la solubilidad • C. de adsorción: se basa en la afinidad de adsorción • C. de exclusión: separa solutos según el peso molecular • C. de intercambio iónico: separa solutos según la carga iónica Cromatografía líquida

  33. La cromatografía de reparto está formada por la cromatografía Líquido-Líquido y la cromatografía unida químicamente. Estas técnicas se diferencian en la forma en que se retiene la fase estacionaria sobre las partículas del soporte relleno. En el segundo caso, como su nombre lo indica, la fase estacionaria se une químicamente a la superficie del soporte. Esta técnica actualmente es la más usada debido a que la cromatografía líquido-líquido necesita de un recubrimiento periódico de las partículas del soporte debido a la pérdida de la fase estacionaria por disolución en la fase móvil. Cromatografía de reparto

  34. Tipos de columnas Usos • En general la cromatografía Líquido-Sólido es más adecuada para muestras que son solubles en disolventes no polares y por ello tienen solubilidad limitada en disoluciones acuosas que son las que se utilizan en cromatografía de reparto en fase inversa. • También se pueden separar compuestos con diferentes grupos funcionales. • Capacidad para diferenciar compuestos isómeros en mezclas. • Los rellenos de columna en la cromatografía de fase unida químicamente se clasifican como de fase inversa cuando el recubrimiento enlazado tiene carácter no polar, y de fase normal cuando el recubrimiento contiene grupos funcionales polares

  35. En general se considera preferible la elución isocrática ya que el comportamiento de la retención es más reproducible, la contribución al fondo por la fase móvil en el espectro de UV-Vis no cambia durante el cromatograma y el cuantitativo es más eficaz. Sin embargo para cubrir el amplio rango de compuestos se han propuesto eluciones en gradiente o columnas con diferente fase estacionaria acopladas en serie. • A estas mejoras en la separación se ha unido la práctica generalización del uso del detector de fotodiodos (Diode Array Detector, DAD) que posibilita la obtención de datos del espectro UV durante el tiempo de cromatograma y la detección de impurezas, aplicando el análisis multicomponentes para efectuar análisis cuantitativos válidos independientemente de la resolución o anchura de pico. Es muy versátil y ofrece importantes ventajas, comparado con el detector UV convencional, en el barrido de muestras desconocidas Otros tipos de detectores (fluorescencia, electroquímico) más sensibles y específicos, no se utilizan en barridos de muestras desconocidas ya que suelen necesitar derivatización y no suelen permitir eluciones en gradiente

  36. El uso de RP-HPLC para un screening de drogas no ha recibido la misma atención debido a la pobre especificidad de una detección UV a longitud de onda simple (el método mas ampliamente usado en los principios de la HPLC) y por que la naturaleza selectiva de la separación usualmente se destina a separar solamente pocos componentes. • El advenimiento de los detectores UV/Visible por arreglo de diodos (DAD) para HPLC ha perfeccionado la selectividad de la técnica mencionada, de tal manera que este puede dar datos múltiples acerca de cada pico, permitiendo la identificación a través de los tiempos de retención , espectros de absorción y coincidencia espectral. • Este método permite asegurar, dentro de ciertos limites la integridad de un pico cromatográfico.

  37. COLUMNAS SPE: Una importante mejora son los métodos de extracción en fase sólida (SPE), que usan pequeñas columnas rellenas de gránulos de fases sólidas apolares, polares o de resinas iónicas. Más recientemente se han implantado resinas mixtas, constituidas por fases sólidas apolares y/o polares funcionalizadas con grupos intercambiadores iónicos ácidos o básicos. Pretratamiento de las muestras

  38. Los resultados del estudio indican que la extracción SPE seguida de la corrida del eluato por HPLC-DAD es efectiva en la deteccion de drogas en muestras de orina, sangre, plasma, contenido estomacal, viseras, pelos, uñas, alimentos, etc. • El procedimiento es rápido, fácil de realizar y consigue una excelente recuperación de todos los compuestos investigados incluyendo opiáceos, beta bloqueantes, fenotiacinas, benzodiacepinas, estimulantes y depresores, • Estas clases de drogas representa una porción de los compuestos frecuentemente encontrados en un screening de drogas e incluye compuestos que a menudo requieren procedimientos analíticos especiales tales como, morfina, benzoilecgonina, oxazepam, diazepam, bromazepam y otras benzodiacepinas.

  39. La muestra se volatiliza y se inyecta en la cabeza de una columna cromatográfica. • La elución se produce por el flujo de una fase móvil de gas. • La fase móvil no interacciona con las moléculas del analito; su única función es la de transportarlo a través de la columna. • Existen dos tipos de cromatografía de gases: • la cromatografía gas-sólido (GSC): la fase estacionaria es sólida, adsorción. • la cromatografía gas-líquido (GLC), más usada, donde la fase estacionaria es líquida, y los analitos se separan mediante reparto. • En ambas técnicas, el desplazamiento de la fase móvil, se realiza mediante presión constante. Cromatografía gaseosa

  40. Tipos • Detectores según su Grado de Selectividad : -Universales. -Específicos ó Selectivos. • Detectores Destructivos y No destructivos. • Detectores según su Modo de Respuesta: -Dependientes del Flujo Másico. Producen una señal que es proporcional a la cantidad de soluto que pasa a través de él en la unidad de tiempo pero es independiente del volumen de gas portador requerido para la elución. -Dependiente de la Concentración. Dan una señal proporcional a la cantidad de soluto por unidad de volumen de gas portador que pasa a través de él. • Detectores según el proceso de detección: Ionización, Óptico-espectroscópico, Electroquímico, etc. • Es un dispositivo para revelar la presencia de las sustancias eluídas a la salida de la columna cromatográfica. • Es capaz de convertir una propiedad física, no medible directamente, en una señal elaborable y ofrecernos información sobre la naturaleza y magnitud de la propiedad física. • Compara una propiedad física entre el gas portador puro y el mismo gas portador llevando cada uno de los componentes que previamente se han separado en la columna. • Esta acción se traduce en una señal de tipo eléctrica, que posteriormente se amplificará mediante un registrador gráfico ó integrador permitiendo indicar el momento de salida. ( TR) Detectores

  41. Permite analizar con una gran precisión la composición de diferentes elementos químicos e isótopos atómicos, separando los núcleos atómicos en función de su relación masa-carga (m/z). • Puede utilizarse para identificar los diferentes elementos químicos que forman un compuesto o determinar el contenido isotópico de diferentes elementos en un mismo compuesto. • mide razones carga/masa de iones, calentando un haz de material del compuesto a analizar hasta vaporizarlo e ionizar los diferentes átomos. • El haz de iones produce un patrón específico en el detector que permite analizar el compuesto químico. Espectrómetro de masa

  42. En términos generales, moléculas diversas tienen masas diversas, hecho utilizado por un espectrómetro de masas para determinar qué moléculas están presentes en una muestra • Se vaporiza una muestra obteniendo iones que poseen pesos moleculares específicos y una carga y debido a ella tendrán movimiento bajo influencia de un determinado campo eléctrico. • Después se aplica un campo magnetico a un lado del compartimiento que atrae a cada uno de los iones y se los desvía sobre el detector. • Los iones más ligeros se desviarán más que los iones pesados porque la fuerza aplicada a cada ion es igual pero los iones ligeros tienen menos masa y se desviaran más. • El detector mide exactamente cuánto de lejos se ha desviado cada ion y, a partir de ese, dato se calcula el "cociente masa por unidad de carga". Con esta información es posible determinar con un alto nivel de certeza cuál es la composición química de la muestra original

  43. Actualmente, el elemento de detección por excelencia es el ya nombrado electromultiplicador. • Su funcionamiento se basa en el efecto cascada producido al impactar un determinado ion (o iones) en el mismo. • Aplicando una diferencia de potencial entre sus extremos, se consigue el aumentar el factor de amplificación, que vendrá determinado por el número de subetapas amplificadoras que componen el detector. • Normalmente es un componente sometido a desgaste que ha de reemplazarse con el tiempo al perder eficiencia de amplificación.

  44. La derivatización de los extractos, aunque prolonga el tiempo requerido para realizar un análisis, disminuye su costo, mejora la especificidad, la sensibilidad, la precisión, la linealidad de los análisis, mejora la estabilidad de los analitos y evita la descomposición térmica de los mismos. • Son susceptibles de una derivatización las moléculas que contengan grupos funcionales tales como -COOH, -OH, -SH, y NH2, y los procedimientos mas utilizados son la silanización, (para compuestos que contienen grupos -OH, -NHR o NH2) alquilación, y acilación. Hidrógenos activos en las moléculas se sustituyen generalmente por tres grupos alquilos. Derivatización

  45. N,O-bis-trimetilsililtrifluoroacetamida ( BSTFA ). • N,O-bis-trimetilsililacetamida ( BSA ). • N-metil-N-trimetilsililtrifluoroacetamida ( MSTFA ). • Hexametildisilasano ( HMDS ) + piridina. • Trimetilclorosilano ( TMCS ) + piridina. • AnhidridoPentafluoropropiónico. ( PFPA ). • AnhidridoTrifluoroacético ( TFAA ). • N-metil-n-ter-butildimetilsililtrifluoroacetamida (MTBSTFA). • t-butildimetilsililtrifluoroacetamida ( TBDMTFA ). • Hidróxido de Tetrametilamonio ( TMAH ). • AnhidridoHeptafluorobutírico ( HFBA ). Agentes derivatizantes

  46. El extracto de la orina evaporado a sequedad en un tubo cónico, se le añaden 20 ul de BSTFA ó BSA y se calienta a 85 °C por 15 minutos. Estos agentes se pueden mezclar con piridina en una proporción de 1:1 e inyectar directamente en el cromatógrafo. • Condiciones cromatográficas: • Columna: de 2 m por 2-4 mm DI empacada con dimetilsilicona ( SE-30 ) o Fenilmetilsilicona con 50 % de fenilo ( OV-17 ). • Gas Portador: N2 70 ml / min. • Temperaturas: Inyector: 275 °C • Horno: 230 °C • Detector (FID): 275 °C Confirmación de Morfina por GC

  47. El extracto de la orina evaporado a sequedad en un tubo cónico, se le añaden 50 ul de BSTFA y de TMCS y se calienta a 60 °C por 10 min. • Condiciones Cromatográficas: • Columna: de 2 m po r 2 mm DI empacada con dimetilsilicona al 3 % (OV-1) o 3 % de fenilmetilsilicona y 50 % de Fenilo (OV-17). • Gas Portador: N2 o He 30 ml / min.- • Temperaturas: Inyector: 260 °C. • Horno: 255 °C. • Detector (FID): 275 °C Confirmación de THC por GC

  48. El extracto de la orina evaporado a sequedad se le añaden 50 ul de PFDA y 25 ul de pentafluoropropanol y se calienta la mezcla a 90 °C por 15 min. Se evapora a sequedad y se reconstituye en 25 ul de acetato de etilo. • Condiciones Cromatográficas: • Columna: de 2 m por 2-4 mm DI SE-30, OV-1 o OV-17. • Gas Portador: N2 30 ml / min. • Temperaturas: Inyector: 220 °C. • Horno: 220 °C. • Detector (FID): 300°C. Confirmación de Cocaína por GC

  49. Bibliografía Bonnet, Emili; “MEDICINA LEGAL”; Lopez Libreros Editores; Buenos Aires; 1967 Fabre y Truhaut , “TOXICOLOGIA”.1 Ed. Paraninfo. Madrid 1976 Moffat,A, “CLARKE¨S ISOLATION AND IDENTIFICATION OF DROUGS. “2nd. Ed. A.C.Mofat and Col. The Pharmaceutical Press. London 1986. Saferstein, R, “CRIMINALISTICS AND INTRODUCTION TO FORENSIC SCIENCE” Ed. Regent/Prentice Hall. New Jersey. 4a ed. 1990 “GAS CHORMATOGRAPHIC RETENTION INDICES OF TOXICOLOGICALLY RELEVANT SUBSTANCES ON PACKED OR CAPILLARY COLUMNS WITH DIMETHYLSILICO (NE STATIONARY PHASES” 3rd Ed. Report XVIII of the DFG Commission for Clinical-Toxicological Analysis special Issue of the TIAF Bulletin. VCH verlagsgsellschtt mbH D-6940 Weinheim (Federal Republic of Germany).1992. Iovine-Selva. “EL LABORATORIO EN LA CLÍNICA”. Ed. Panamericana. Buenos Aires. 1993 J.A. GisbertCalabuig, “MEDICINA LEGAL Y TOXICOLOGIA” 5ta. ed. Ed. Masson Madrid 1998

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