Part 1

1. Part 1

23. ADN con mutación en el gen ADN con Gen normal

26. Primer 5’ ---OH ----CTAAGCTCGACT 3’ Template dCTP,dGTP,dATP,dTTP + ddTTP + ddCTP + ddATP + ddGTP ----GATTCGAGCddT ----GATddT ----GAddT ----GATTCGAGTddC ----GATTddC ----GATTCGAGCTGddA ----GATTCGddA ----GddA ----GATTCGAGCTddG ----GATTCGAddG ----GATTCddG ----ddG A G T C G A G C T T A G 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 Autoradiogram of Electrophoresis gel SEQUENCE OF COMPLEMENTARY STRAND

30. Secuenciación REACCIONES para la secuenciación de DNA: Similar a la PCR. Incluye el dsDNA, nucleótidos libres, la enzima (una variante de la Taq polimerasa) y el primer, que se hibrida a una de las hebras del DNA. Una nueva hebra de DNA se sintetiza. Si se empieza con un billon de piezas, se obtendran 1 billon de nuevas copias de una de las hebras en un ciclo. La amplificación es lineal, no exponencial, ya que el producto no sirve como molde. La reacción se lleva a cabo con la presencia de un porcentaje de didesoxinucleótidos: Estos no poseen -OH en el extremo 3´, de manera que cuando se adionan al final de la hebra, la misma no puede seguir elongándose. La mayoria de los nucleótidos de la mezcla son normales, sólo una pequeña fracción son didesoxinuclótidos. 34

31. Secuenciación Producto normal Productos en el caso de que 5 % de T sean didesoxi-T Todos los fragmentos terminan en T. Para saber su posición, debemos conocer el tamaño de los fragmentos!!!!!!!!!!!!!!! Mediante ELECTROFORESIS EN GEL

32. Secuenciación Productos en el caso de que 5 % de C sean didesoxi-C (ddC) modificado con una molécula fluorescente al UV que da color azul

33. Secuenciación Si se colocan simultáneamente 5 % de ddC, ddA, ddT y ddG modificados con moléculas fluorescentes que den distintos colores, se puede deducir por el tamaño de las bandas la secuencia del DNA

34. Secuenciación Estas pruebas se realizan con secuenciadores automáticos En un gel se pueden procesar 96 líneas con diferentes muestras. • Así, se pueden secuenciar fragmentos de 700 pb. Sin embargo, el genoma humano tiene 3 billones de pb en 23 pares de cromosomas!!!!!!!!!!!!

36. C O Síntesis de oligonucleótidos Hebras de DNA se pueden sintetizar por adición secuencial de monómero activados a una cadena en crecimiento unida a un soporte insoluble 5´ La SÍNTESIS se realiza en FASE SÓLIDA SOPORTES: Partículas de poliestireno vidrio derivatizado con funciones –COOH VENTAJAS: reacción cuantitativa (rendimiento de 95 al 98 %) usa exceso de reactivos que se eliminan por filtración es fácilmente automatizable menos riesgo de contaminación 3´ Sintetizador automático de DNA ESCALA: umol-nmol de producto oligonucleótidos de 100 ( y hasta 200) mer Existen muchos sistemas comerciales

39. Síntesis de oligonucleótidos

40. Síntesis de oligonucleótidos. CE fosforamiditas El monómero activado es desoxirribonucleósido 3’ fosforamiditas protonadas. Se usa DMT (dimetoxitritilo) para proteger el -OH en 5´ (estable en medio básico pero lábil en medio ácido) y el grupo b-cianoetil para bloquear el grupo fosforilo en 3´. Las aminas de las bases se protegen con: benzoil, isobutiril, dimetilformamidina Finalmente, el producto se separa del soporte y se purifica: HPLC Sintetizador automático de DNA ESCALA: umol-nmol de producto oligonucleótidos de 100 ( y hasta 200) mer Existen muchos sistemas comerciales 53

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45. Part 1