OD POMYSŁU DO ZASTOSOWANIA

1. CHIPY BIAŁKOWE OD POMYSŁU DO ZASTOSOWANIA Na podstawie pracy: ‘Protein chips: from concept to practice’ Young-Sam Lee i Milan Mrksich Jakub Gruszczyk Anna Piłat

2. Inaczej mikromacierze, czujniki, znaczniki Mogą być zarówno DNA jak i białkowe Wyniki badań przeprowadzone przy ich użyciu można przedstawić wzorami złożonymi z różnobarwnych kropek Po raz pierwszy zostały wprowadzone na rynek w 1996 (mikromacierze DNA) Pozwalają na szybką, łatwą i równoczesną analizę tysiąca elementów w pojedynczym eksperymencie Są stosowane do analizy oddziaływań (antygen-przeciwciało, białko-białko, białko-kw.nukleinowy, białko-lipid, enzym-substrat) Co to są chipy ?

4. Przykłady zastosowań chipów białkowych • Niesłychanie przydatne w badaniu biologii komórki, • mechanizmy badania nowotworów a także odkrycie molekularnych przyczyn wielu złożonych chorób, • szybka diagnoza chorób i prognozowanie ich przebiegu, • testowanie leków, podstawowe narzędzia do stworzenia nowych lekarstw, • możliwość dostosowania terapii do indywidualnych potrzeb pacjenta, • określanie typów białek oraz mierzenia ich ilości w tkankach.

6. Immobilizacja białek • Reakcja grupy aminowej lizyny z zmodyfikowaną grupą aldehydową (znalazły zastosowanie w charakterystyce oddziaływań białko-białko a także badaniach produktów pośrednich powstałych w wyniku fosforylacji przez odpowiednie kinazy), • inny przykład zastosowania: do indentyfikacji nowych klas kalmodulin i fosfolipidów wiążących białka, • białka znakowane His-tag (łatwiejsze oczyszczanie).

7. Białkowe chipy używane do analizy aktywności białek drożdży • Kilka tysięcy białek fuzyjnych z GST unieruchomionych na płytce • Związanie przeciwciał anty-GST • Identyfikacja białek wiążących kalmodulinę i fosfatydyloinozytole

8. Konstrukcja macierzy przeciwciał • Immobilizacja bibliotek fagowych prezentujących fragment scFv przeciwciała na papierowym filtrze w celu selekcji przeciwciał względem specyficznych antygenów, • stworzenie molekularnie zdefiniowanych macierzy, badanie reakcji przeciwciała z pokrewnymi antygenami, zastosowanie w medycynie macierzy przeciwciał rozpoznających 75 różnych cytokin; detekcja ilości femtomolowych.

9. Problemy związane z białkowymi chipami • Niektóre interakcje zdefiniowane innymi metodami nie zostały potwierdzone. Przyczyną mogą być : • brak jednolitości w aktywności immobilizowanych białek, • immobilizacja białek w różnej konformacji, • częściowa denaturacja białek na powierzchni, • niespecyficzna adsorpcja białek do chipów (blokowanie na powierzchni z BSA, niekontrolowana adsorpcja białek z roztworu).

11. Zastosowanie do immobilizacji dobrze zdefiniowanych powierzchni • Oddziaływanie pomiędzy cząsteczkami zależy od wpływu otoczenia, • nieznaczne zmiany w środowisku mają wpływ na zachowanie aktywności, • istnieje zatem konieczność ujednolicenia warunków, w jakich znajdują się poszczególne immobilizowane cząsteczki.

12. Rozwinięcie strategii immobilizacji • Kontrola przywarcia, • gęstość ligandu, • wiązanie białka do substratu (ocena aktywności immobilizowanych białek-region aktywny może być związany z sąsiednim białkiem lub powierzchnią macierzy i poprzez to może być zahamowana jego aktywność), • His-tag może wiązać się do szklanej powierzchni prezentującej odpowiednią grupę chelatową.

13. Użycie biernych chemicznie i fizycznie powierzchni • Powierzchnia bierna zapobiega zarówno niespecyficznej adsorpcji jak i denaturacji immbilizowanych białek, • idealne podłoże do przygotowania chipów białkowych, • wypierają one stopniowo stosowane dotychczas metody polegające na: • blokowaniu powierzchni przy pomocy BSA, co może prowadzić do niespecyficznych oddziaływań, • przeprowadzaniu eksperymentu w obecności detergentu, co może przeszkadzać w oddziaływaniach.

14. DETEKCJA Użyteczność każdego rodzaju mikromacierzy zależy od tego, jaka technika zostanie zastosowana do jej analizy. Zazwyczaj stosuje się detekcję opartą na fluorescencji lub zastosowaniu sond radioaktywnych w celu określenia związania się białek lub przeciwciał do macierzy.

15. DETEKCJA Sposoby detekcji ilości wiążącego się białka: • Znakowanie białka sondą a następnie inkubacja na macierzy ; po odmyciu macierz jest analizowana w celu wykrycia obecności znakowanego białka i określenia typu związanego partnera, • w celu identyfikacji określonej aktywności enzymatycznej, np. oznaczenie aktywności kinazowej polega na zastosowaniu przeciwciał przeciwko fosfotyrozynie, co pozwala na identyfikację substratów tych enzymów.

16. PORÓWNANIEMETODDETEKCJI

17. DETEKCJA Chociaż zastosowanie znaczników fluorescencyjnych i radioaktywnych odznacza się wysoką czułością i rozdzielczością posiada jednak pewne ograniczenia: • modyfikacja białka przy pomocy sondy ma wpływ na jego aktywność, • koszt i utylizacja szczególnie w przypadku radioizotopów, • ograniczenie do badania tylko tych oddziaływań, dla których cząsteczki zostały wyznakowane, a nie pozwala na odkrywanie nowych właściwości.

18. DETEKCJA Przykład dwóch technik nie wymagających znakowania białek i pozwalających na analizę skomplikowanych próbek o złożonym i często niezdefiniowanym składzie: SPR MALDI-TOF

19. MALDI-TOF • MALDI-TOF Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization (źródło jonów) Time Of Flight (analizator) jest jedną z technik spektrometrii masowej, • wykorzystuje ona impuls laserowy w celu jonizacji próbki, • energia lasera przekazywana jest matrycy zmieszanej z badaną próbką i przenoszona na analizowaną substancję, • najczęściej stosowane matryce: kwas sinapinowy, kwas a-cyjanohydroksycynamonowy (aCHCA), kwas 2,5-dihydroksybenzoesowy (DHB).

20. MALDI-TOF • W wyniku uderzenia laserem próbka ulega jonizacji, co jest warunkiem jej przyśpieszenia w polu elektrycznym, • jony analizowane są za pomocą detektora czasu przelotu, w którym jony cięższe docierają do detektora wolniej niż jony lżejsze, • wynikiem analizy jest zawsze wartość m/z.

21. MALDI-TOF

22. MALDI-TOF Widmo MALDI TOF mioglobiny końskiej (po lewej) i jej mapy peptydowej powstałej w wyniku trawienia trypsyną (po prawej).

23. MALDI-TOF Zalety techniki: • możliwość analizowania substancji o masach nawet do miliona [Da], • dodatek nadmiaru matrycy w stosunku do analitu ogranicza powstawanie agregatów i ułatwia formowanie jonów molekularnych, • nie ma potrzeby dostrajania długości fali lasera do częstotliwości absorpcji analizowanych próbek, • desorpcja związku zachodzi w łagodnych warunkach, zatem można badać enzymatyczne modyfikacje różnych białek, • umożliwia identyfikację białek związanych do macierzy poprzez potraktowanie enzymami proteolitycznymi a następnie analizie otrzymanych peptydów.

24. Surface Plasmon Resonance(SPR) • Surface Plasmon Resonance (SPR) jest techniką, która pozwala na badanie w czasie rzeczywistym oddziaływań międzycząsteczkowych, • wiązanie i dysocjacja są mierzone w jednostkach względnych a wyniki są przedstawiane w formie wykresu nazywanego sensorgramem, • możliwa jest analiza nie tylko oddziaływań białko-białko, ale także: DNA-DNA, DNA-białko, lipid-białko, itp. • Analiza oddziaływań pozwala na określenie: • ile cząsteczek bierze udział w oddziaływaniu, • siły tego oddziaływania, • stałych szybkości asocjacji i dysocjacji. • Ponadto możliwa jest analiza ilościowa po wykreśleniu krzywej kalibracyjnej.

25. SPR Główne zalety techniki: • możliwość zastosowania nieznakowanych cząsteczek, • możliwość pracy in situ, reagenty po związaniu nie musza być przepłukiwane i suszone przed analizą; ma to szczególne znaczenie do badań oddziaływań o niskim powinowactwie a zatem stabilności.

26. SPR zasada pomiaru • Jedna z oddziałujących cząsteczek unieruchomiona zostaje na specjalnym szkle pokrytym warstewką złota, które stanowi jedną ze ścianek cienkiej komórki przepływowej, • druga cząsteczka podawana jest w formie rozpuszczonej w odpowiednim buforze i przepływa wraz ze strumieniem cieczy nad powierzchnią złota, • światło z zakresu VIS lub IR pada poprzez pryzmat i szklaną płytkę na warstewkę złota, • w zależności od otoczenia atomy złota mają różną zdolność do odbijania światła a przez to są bardzo czułe na zmiany zachodzące w ich pobliżu, wynikające na przykład ze związania innej cząsteczki, • czułość reakcji atomów złota związana jest z bardzo wydajnym wzbudzeniem elektronów przewodzenia na powierzchni warstewki złota.

27. SPR http://home.hccnet.nl/ja.marquart/Sensorchips

28. SPR

29. PODSUMOWANIE • Chipy białkowe mogą dostarczyć wielu interesujących informacji na temat oddziaływań pomiędzy biocząsteczkami, • mają one ogromną szansę stać się powszechnym narzędziem także w diagnostyce, • rozwój w tej dziedzinie skorelowany jest z rozwojem różnorodnych technik immobilizacji białek, • metody, takie jak MALDI-TOF czy SPR, stanowią konkurencyjne i pełne nowych możliwości sposoby analizy chipów białkowych.

30. LITERATURA • ‘Protein chips: from concept to practice’ Young-Sam Lee, Milan Mrksich TRENDS in Biotechnology Vol. 20 No. 12, 2002 • Adam Dubin, Wprowadzenie do chemii białek, Kraków 2003 • http://www.chemia.uj.edu.pl/slafibs/ms_opis.htm • http://home.hccnet.nl/ja.marquart/Sensorchips • http://home.hccnet.nl

31. DZIĘKUJEMYZAUWAGĘ 