Modul: Dýchání - respirace Glykolýza Cytosolické a plastidové procesy Cyklus kyseliny citrónové

1. Modul: Dýchání - respirace • Glykolýza Cytosolické a plastidové procesy • Cyklus kyseliny citrónové • Mitochondriální elektronový transport a syntéza ATP • Metabolismus lipidů • Inovace studia botaniky prostřednictvím e-learningu CZ.1.07/2.2.00/07.0004

2. Dýchání – Respirace • Mnohastupňový oxido-redukční proces • – přijímaným kyslíkem se oxidují energeticky bohaté organické sloučeniny na CO2 a vodu (výdej do prostředí) • uvolněná energie v podobě ATP je využívána k tvorbě látek využitelných v dalších metabolických procesech • - probíhá ve všech orgánech na světle i ve tmě. • - ve fotosyntetizujících pletivechje část energie ze sekundárních pochodů fotosyntézy přímo převáděna do metabolických cyklů. (ATP z fotofosforylace je spotřebováno pouze v chloroplastech) • v heterotrofních orgánech a za tmyje energie dodávána pouze respirací. • Výchozí sloučeniny (respirační substráty) – sacharidy – glukosa, sacharosa, škrob nebo látky od nich odvozené - tuky a zásobní bílkoviny.

3. Zásoby, floémový transport Cytosol škrob Sacharidy Hexosa -P Hexosa -P Pentoso-P cyklus PLASTID Triosa -P Triosa -P CO2 NADPH Fotosyntéza Organické kyseliny zásoba NADPH Mitochondrie Citrát. cyklus Anaerobní glykolysa

4. Zisk respirace – metabolická energie v podobě ATP - redukční potenciál v podobě redukovaných koenzymů – dehydrogenas (NADH2,NADPH2,FADH2) - meziprodukty k různým buněčným syntézám - tepelnou energii

5. ATP– hlavní produkt respirace vzniká - substrátovou fosforylací v glykolyse a v Krebsově cyklu - oxidační fosforylací v mitochondriích

6. Pentosofosfátový cyklus - „obrácený Calvinův cyklus“ - probíhá v cytoplasmě a plastidech - začíná oxidací glukosa – 6 – fosfátu - meziprodukty jsou využívány k buněčným syntézám, tvorba glyceraldehyd-3-fosfátu - vznik 2NADPH + H+, které mohou být využity v respiračním řetězci - ATP se zde substrátovou fosforylací netvoří

7. Mitochondrie • – dekarboxylace pyruvátu a • vznik acetyl koenzymu A • Krebsův cyklus • respirační řetězec • oxidační fosforylace • fotorespirace • oxidace mastných kyselin • (odbourání tuků) u živočichů Cytoplasma Glykolýsa Pentosový cyklus Etapy respirace • Glyoxysomy - u rostlin • - enzymy oxidace mastných kyselin • Glyoxalátový cyklus

8. Mitochondrie - Různého tvaru nejč. elipsovitý, rozdílný tvar mezi druhy, pletivy i v buňce. - Velikost cca 0,1-10 µm Počet 10 – 200000 - V anaerobních buňkách chybí - Shlukují se do míst spotřeby energie - Mají vlastní DNA , fúzují a dělí se Dvoumembránová stavba – kompartmentace dějů Vnější je hladká- volně propustná, proteiny umožňující volnou difúzi mol.do 10kD (poriny) Vnitřní zvrásnělá- tvoří kristy (zvětšení plochy ) - selektivní (CO2,H2O, O2); transportní proteiny (75%), které kontrolují průchod metabolitů a jiných látek. Stopkatá tělíska ATP syntásy. Matrix vnitřní hmota mitochondrie.

9. Vnější membána Mezimemránový prostor Vnitřní membrána Matrix Kristy

10. Glykolysa Fosforylace glukosy řadou kroků na PEP a dále na malát nebo pyruvát. Malát– konečný produkt glykolysy u většiny rostlin (u živočišných buněk pouze pyruvát) a je hlavním substrátem mitochondrií . 1 GLUKOSA oxiduje a dává vznik 2 MALÁTU Nevzniká ATP ani NADH – spotřeba při redukci oxalacetátu na malát 1 GLUKOSA - oxidace vznik 2 PYRUVÁTU = 2ATP, 2 NADH+H Tvorba glykolytických meziproduktů jako výchozích surovin dalších buněčných syntéz. Např. - glyceraldehyd fosfát – glycerolfosfát – glycerol = syntéza tuků - aminace pyruvátu = alanin

11. Sacharosa Plastid Škrob Fruktosa Glukosa Glykolysa- vznik triosa fosfátů – dihydroxy aceton-P a glyceraldehyd-3-P ATP Hexokinasy Fotosyntéza ADP Triosa fosfáty Fruktosa6-P Hexosa-P-isomerasy Glukosa-6-P Pi Glycerátový člunek ATP PPi fosfofruktokinasa ATP - fosfofruktokinasa ADP PPi Aldolasa Triosafosfát isomerů Fruktoso-1,6-bifosfát

12. Glyceraldehyd-P 1,3 - P -glycerát NAD NADH ADP ATP 3-P-glycerát Fosfoglycerát kinasa Pi Glyceraldehyd-3P dehydrogenasa Krebsův cyklus Mitochondrie 2-P-glycerát Pi Enolasa H2O PEP karboxylasa Fosfoenolpyruvát NAD NADH HCO3 Malát dehydrogenasa Malát Oxaloacetát Pyruvát ATP ADP Pyruvát kinasa

13. Glykolysa- probíhá jen pokud je NADH+ + H+ regenerováno na NAD+. Při dostatku kyslíku-tato regenerace probíhá v dýchacím řetězci za vzniku H2O a elektrochemického protonového gradientu mezi mezimembránovým prostorem a vnitřním prostorem mitochondrie. Při nedostatkukyslíku-se akceptorem H+ při regeneraci stává kyselina pyrohroznová ( pyruvát), ze které její redukcí vznikají sloučeniny hromadící se v buňce – etanol nebo laktát. Na anaerobní glykolysu nenavazuje Krebsův cyklus.Pouze tzv. fermentační reakce.

14. Pyruvát Fermentační reakce Anaerobní glykolysa CO2 Laktát dehydrogenasa Pyruvát dekarboxylasa NADH+H NAD+ Acetaldehyd NAD+ NADH+H Alkohol dehydrogenasa Etylalkohol Laktát

15. Tvorba malátu 1) v cytosolu je PEP karboxylován fosfoenolpyruvátkarboxylasou na oxalacetát oxidace malátdehydrogenasou za vzniku malátu, který je transportován do matrix. Uchování a regulace organických kyselin rostliny řeší jejich uchováním ve vakuole (nejen CAM rostliny). 2) v matrix oxidován jablečným enzymem za vzniku pyruvátu a CO2 oxidativní dekarboxylace Tento enzym se vyskytuje v matrix mitochondrií pouze u rostlin. Pyruvát tvořený z malátu vstupuje do reakcí, tvorba acetyl CoA a vstup do Krebsova cyklu. V Krebsově cyklu odbourávání posledních 2C pyruvátu ve formě CO2 a tvorbě 4 redukovaných koenzymů. V jedné z reakcí vzniká ATP (GTP).

16. Pyruvát v mitochondriích dekarboxylace pyruvátu a tvorba acetyl-CoA Pyruvát dehydrogenásový multienzymový komplex TTP – thiamin pyrofosfát amid kyseliny lipoové HS – CoA flavoprotein s FAD pro přenos 2H a reaktivaci kyseliny lipoové • aktivovaná kyselina octová = vstup do Krebsova cyklu Transport malátu a pyruvátu z cytoplasmy do mitochondrií Jedná se o transport přes vnitřní membránu mitochondrií. Pyruvátový transporter – výměna za hydroxylové ionty Dikarboxylátový transporter – malát , sukcinát za ionty Pi

17. Fosfoenolpyruvát Pyruvát KoA Pyruvát CO2 ADP NADH ATP Pyruvát dehydrogenasový komplex NAD+ HCO3 NAD+ NADH PEP karboxylasa AcetylCoA CO2 Jablečný enzym Citrát z cytosolu Oxaloacetát Oxaloacetát Malát dehydrogenasa Krebsůvcyklus NADH Citrát NADH NAD+ NAD+ Malát dehydrogenasa Malát Malát z cytosolu Malát Cytosol Mitochondrie

18. Krebsův cyklus AcetylCoA KoA Oxaloacetát Krebsův cyklus Citrátsyntasa Citrát NADH NAD+ Malát dehydrogenasa Malát Akonitasa Isocitrát Fumarasa NAD+ Fumarát CO2 Isocitrát dehydrogensa FADH Sukcinát dehydrogenasa NADH FAD+ Sukcinát 2-Oxoglutarát 2-oxoglut. dehydrogenasa SukcinylCoA syntasa NAD+ KoA CO2 SukcinylCoA NADH ATP ADP

19. Respirační řetězec– elektronový transportní řetězec, umístěný na vnitřní mitochondriální membráně. Oxidace redukovaných koenzymů. - Transport elektronů z redukovaných koenzymů respiračním řetězcem ke kyslíku za vzniku H2O. - Vylučování protonů z vnitřní strany membrány (matrix) do mezimembránového prostoru mitochondrií. • Vznik transmembránového gradientu protonů, se kterým souvisí syntézaATP v bílkovinném komplexu ATP syntasa (komplex podobný jako v chloroplastech) Přenos elektronů - zajišťují čtyři hlavní komplexy integrálních polypeptidů a další složky respiračního řetězce jako ubichinon (koenzym Q), cytochrom c, AOX.

20. Komplex I. - vstup elektronů z redukovaných koenzymů NADH + H+ které vznikají v Krebsově cyklu do dýchacího řetězce. - prvním místem vylučování protonů H+ z matrix do mezimembránového prostoru - přenos elektronů na přenašeč koenzym Q přenašeč koenzym Q– (ubichinon ; ubihydrochinon) příjmá elektrony z komplexu II. Není pevně vázán na membránu - „putuje“. - přenos elektronů z NAD(P)H+H+ vzniklých v glykolyse a v pentosofosfátovém cyklu z vnější strany membrány (cytosolu) i z matrix. Pro rostliny specifické přenašeče elek. tzv. externí a interní NAD(P)H dehydrogenasy, které přijímají el. produkované v cytosolu nebo matrix a přenáší je na CoQ.

21. Komplex II. – spřažen se sukcinát dehydrogenasou – jediný enzym Krebsova cyklu, který je vázaný na membránu. - produkuje redukovanou formu FADH2předává elektrony z komplexu II. na koenzym Q. Komplex III. – (cytochrom BC1) dochází v něm k oxidaci a redukciCoQ - zprostředkovávápřenos elektronů z redukovaného CoQH2 na - Cytochrom c = periferní protein - transportuje e- z III. ke komplexu IV. Komplex III. Je zároveň dalším místem vylučování 4 H+ do mezimembránového prostoru mitochondrií. Komplex IV. – (cytochrom oxidasa) - terminální oxidasa cytochromové cesty - obsahuje dvě centra obsahující Cu a+b a dva cytochromy a + a3 - přijímá elektrony z Cytochromu c a přenáší je na konečný akceptor kyslík za vzniku H2O - třetím místem vylučování protonů (2H+). Zpětný pohyb protonů komplexem ATPsyntasy je spojen s tvorbou ATP ( oxidativní fosforylace).

22. Mezimembránový prostor 4H 2H 4H NADHP+H NADP+ 3H NADH+H NAD+ Dehydrogenasa Cyt C e- e- Fo e- e- Komlex I NADH dehydrogenasa Koenzym Q Komlex IV Cytochrom Oxidasa Komlex III Cytochromový komplex Komlex V ATP syntasa e- e- e- e- Dehydrogen. Komlex II Sukcinát dehydrogenasa AOX NADH+H NAD+ O2 H2O NADH+H NAD+ FADH+H FAD+ O2 H2O F1 3H Matrix ADP Pi ATP

23. ATP syntasa – je integrální multipodjednotkový transmembránový protein, který funguje jako přenašeč protonů vnitřní membránou mitochondrií. ATP syntasa je složena ze dvou jednotek. F1 je vnější jednotkou, která katalyzuje syntézu ATP. Fo je jednotka tzv.oligomycin citlivá, nerozpustná ve vodě. Obě lze od sebe oddělit močovinou. Jednotka F1 je otáčivá a na základě protonmotivní síly. Obsahuje tři reaktivní centra-protomery, ve kterých dochází vlivem uvolněné energie k navázání ADP+Pi , tvorbě ATP a uvolnění ATP do matrix. Točivý pohyb je zajišťován průchodem protonů (H+) při navázání na karboxylovou skupinu v jednotce Fo.

24. Respirace rezistentní ke kyanidu Kyanid (a další látky) u mnoha pletiv působí jako inhibitory cytochromové cesty přenosu elektronů. • Existence AOX(alternativní oxidasa), enzym je umístěný na vnitřní membráně mitochondrií a je specifický pouze pro některé rostliny. Je rezistentní vůči kyanidu a dalším inhibitorům respiračního řetězce (komplexy III. a IV.) • Tvoří alternativní cestu přenosu elektronů na kyslík. • AOX naváže elektrony na úrovni koenzymu Q a vynechá blokovaný Cytochrom c. • Nedochází k vylučování protonů z komplexu III. a IV. Tvorba jen ½ ATP. Fyziologický význam nejasný – známe pouze: 1) zvýšení teploty v toulci Araceae (zvýšení teploty až o 10°C) 2)Vyzrávání semen (Fraxinus exelsior) 3) Uvolnění přebytečné respirační energie – kdy může dál probíhat aerobní glykolysa, pentosový cyklus a Krebsův cyklus a využívá se produkce mnoha důležitých intermediátů.

25. Tvorba ATP Substrátová fosforylace – probíhá v glykolyse a K-cyklu při enzymatických hydrolýzách 1,3-fosfoglycerátu, PEP, sukcinylCoA Při těchto reakcích dochází k uvolnění energie na fosforylaci ADP a navázání Pi - nižší produkce ATP Oxidační fosforylace– využití membránového gradientu z přenosu protonů do mezimembránového prostoru – využití protonmotorické síly H+ k pohánění ATPsyntasy. Na 1 glukosu vzniká 36-38 ATP v celém dýchacím procesu. Export ATP z mitochondrií– přenos pomocí proteinových přenašečů lokalizovaných ve vnitřní mitochondriální membráně.

26. Výměna některých substrátů přes vnitřní mitochondriální membánu pomocí transportních proteinů Dikarboxylický transportér – umožňuje výměnu dikarboxylových kyselin jako např. malátu, sukcinátu za anorganický fosfát potřebný při tvorbě ATP. Trikarboxylický transportér – umožňuje výměnu citrátu za malát nebo sukcinát. Adenin nukleotidový translokátor – dimerní protein s jedním vazebným místem. Umožňuje kompetitivní výměnu ADP3- z cytosolu za ATP4- z matrix mitochondrie na základě elektrogenního antiportu poháněného rozdílem membránového potenciálu. Fosfátový a pyruvátový nosič – poháněný rozdílným pH matrix a cytosolu, které vytváří transmembránový protonový gradient.

27. Mitochondrie Pyruvátový přenašeč H+ H+ H+ H+ H+ Fo Pyr- Fosfátový přenašeč F1 H+ H+ ADP3- ATP4- OH- H+ Krebsův cyklus FADH+H 4 NADH+H Pi- OH- H+ VI. Matrix pH 8,0 H+ III. II. H+ I. H+ Pi2- Malát2- Malát2- ATP4- H+ H+ Citrát2- Cytosol pH 7,5 ADP3- H+ Adenin nukleotidový přenašeč Dikarboxylátový přenašeč Trikarboxylátový přenašeč

28. Amfibolické funkce citrátového cyklu a glykolýzy - Katabolické - odbourávání CO2 - Anabolické – využití meziproduktů v dalších syntézách -anaplerotické reakce – doplňování produktů do Krebsova cyklumalát, ( PEP) sukcinyl CoA (odbourávání MK s lichým počtem C) 2-oxoglutarát, oxaloacetát ( z AK) -kataplerotické reakce – využití meziproduktů Krebsova cyklu k jiným syntézám biosyntéza MK (A-CoA) biosyntéza AK (z oxaloacetátu, 2-oxoglutarátu) porfirínové skelety (sukcinyl CoA)

29. Sacharosa Nukleové kyseliny ATP, ADP NAD NADP, FMN Cytokininy Nukleotidy Pentosofosfáty Hexosafosfáty Celulosa Alkaloidy Flavonoidy Dihydroxy aceton-P Glaceraldehyd3-P Fenylalanin Tyrosin Tryptofan Glycerol-3-P Kys. šikimátová PEP IAA Lipidy Proteiny Alanin Pyruvát Acetyl CoA Mastné kyseliny Krebsův cyklus Citrát Asparát Karotenoidy Gibereliny ABA Oxaloacetát Proteiny Tvorba významných meziproduktů v respiraci 2-Oxoglutarát SukcinylCoA Glutamát Porfirínové skelety Chlorofyly Fytochromy Cytochromy Am.kyseliny

30. Glyoxalátový cyklus(anaplerotická reakce) • u rostlin, plísní a bakterií • Obsahují enzymy, které katalyzují konverzi A-CoA na oxaloacetát. Glyoxalátový cyklus obsahuje některé enzymy Krebsova cyklu (isocitrátlyasa,malátsyntasa – přítomné pouze u rostlin) • v olejových tělískách, glyoxyzomech, mitochondriích, cytosolu • 2 mol. A-CoA, který je produkovaný v β- oxidaci mastných kyselin se metabolizuje na sukcinát dále malát nebo oxaloacetát v cytosolu, což je cesta tzv. glukoneogeneze = kdy z mastných kyselin se tvoří sacharidy, které jsou využity pro počáteční růst a vývoj klíčních rostlin. • využití triacylglycerátů u klíčních rostlin (Helianthus annuus, Ricinus communis, atd.)

31. Tuková tělíska Glukosa ACoA carboxylasa Glyoxysom Triacylglyceroly CoA Mastné kyseliny Lipasa ACoA Hexosy NAD+ AMP ATP ACoA Oxalacetát NADH+H NADH+H PEP CoA β-oxidace MK NAD+ Citrát CO2 ADP Glyox. cyklus Malát PEP karboxykinasa CoA Isocitrát ATP Malát syntasa n ACoA Oxaloacetát Isocitrát lyasa Glyoxalát Sukcinát NADH+H Malát dehydrogenasa NAD+ Mitochondrie Malát Fumarát Sukcinát Malát H2O FADH+H FAD+

32. Faktory ovlivňující rychlost respirace Vnitřní faktory– regulace rostlinné transpirace Některé substráty respirace stimulují enzymy v dřívějších krocích respirace. Naopak kumulace některých produktů respirace tyto reakce inhibuje. Např. vysoký poměr ATP/ADP inhibuje glykolytické enzymy, přenos elektronů v respiračním řetězci = celou respiraci. NADH+H+ inhibují některé fáze Krebsova cyklu. PEP inhibuje počáteční reakce glykolýzy

33. Fruktoso-6-P Fruktoso-1,6-P PEP Pyruvát A-CoA KC Oxaloac. Citrát Malát Isocitrát 2-oxogl. NADH+H NAD+ Respirační řetězec ATP ADP Pi

34. Vnější faktory ovlivňující respiraci Kyslík– rostliny nemají specifický vazač O2 rozvod - pomocí intercelulár (aerenchym) - vodné roztoky v xylému a floému Nedostatek kyslíku výrazně omezuje respiraci! Plody, bulvy hlízy – kompaktní orgány bez intercelulár příjem O2 pomocí difúze. Teplota - při vyšší teplotě vzrůstá intenzita respirace a projevuje se nedostatek O2 snížením rychlosti difúze a klesá rozpustnost kyslíku ve vodě. Nedostatek O2 pro aerobní oxidaci se projeví tvorbou produktů anaerobní glykolysy (ethylalkohol, laktát).

35. Podzemní orgány – zaplavení půdy nebo její slehnutí = nedostatek O2 pro kořeny (pomalejší difúzeO2 ve vodě 10000x pomalejší, nižší koncentrace O2 ) Hypoxie – snížené množství O2 Anoxie – prostředí bez O2 (Tisovec dvouřadý – Taxodium distichum) - pneumatofory Pokles respirace = pokles tvorby ATP v kořenech, potlačení syntézy RNA a bílkovin, které se projeví sníženým aktivním příjmem živin a vody kořeny. Dlouhodobé zaplavení neadaptovaných rostlin způsobí jejich usychání a smrt. Kořeny získávají energii pouze z anaerobní glykolysy, tvorba laktátu snížuje pH cytosolu buňky, které může způsobit i smrt buňky. Hromadění ethanolu a laktátu je méně škodlivé než nízká tvorba ATP anaerobní glykolysa …………..2 ATP na molekulu glukosy aerobní glykolysa……………..36 ATP

36. Fyziologický význam respirace Udržování pletiv a buněk při životě– využití ATP pro tvorbu bílkovin a pro tvorbu gradientů protonů na membránách Růst– ATP, NAD(P)H + H+ a respirační meziprodukty pro různé biosyntézy v rostlinách Transport látek– příjem min. živin kořeny, aktivní transport floémem = spotřeba ATP Redukce nitrátů– spotřeba NAD(P)H+H+ Redukce sulfátů- v kořenech, spotřeba ATP a NAD(P)H + H+

37. Modul: Dýchání – respirace. • Glykolýza Cytosolické a plastidové procesy • Cyklus kyseliny citrónové • Mitochondriální elektronový transport a syntéza ATP • Metabolismus lipidů • Inovace studia botaniky prostřednictvím e-learningu CZ.1.07/2.2.00/07.0004