KÜL- ÉS BELTENYÉSZTETT, TRANSZGENIKUS ÉS GÉNKIÜTÖTT ÁLLATOK. KLÓNOZÁS

1. KÜL- ÉS BELTENYÉSZTETT, TRANSZGENIKUS ÉS GÉNKIÜTÖTT ÁLLATOK. KLÓNOZÁS Dr. JánossyTamás SZTE, ÁOK, Sebészeti Műtéttani Intézet

2. Modellválasztás az orvostudományi és a biológiai kutatásokban 1. A megfelelő állatfaj kiválasztása: Leggyakrabban használt állatfajok: Háziállatok: szarvasmarha, sertés, baromfi, kutya, macska Nem ember főemlősök: majom, csimpánz, cerkófmajom, selyemmajmok Kis laboratóriumi emlősök:egér, patkány, tengerimalac, hörcsög, nyúl Ezek a leggyakoribbak: kis helyigény, szaporaság, rövid tenyészidő 2. A megfelelő genetikai tényezők, tulajdonságok kiválasztása: pl. változatos v. azonos állatok

3. Kültenyésztés:a rokontenyésztés elkerülésegenetikailag változatos állomány <100 tenyészpár: a rokontenyésztés maximális elkerülése >100 tenyészpár: rotációs v. találomra történő (random tenyésztés) A beltenyésztési együttható (a homozigóta génhelyek gyakoriságának) növekedése: <1% A kültenyésztett (outbred) állomány egyedei heterozigóták: az apai (A) és az anyai gének (B) alléljei a génhelyek túlnyomó részébenkülönbözőek (AB). A populáció anizogén: egyedei genetikailag különböznek (változatos genotípusúak).

4. Zárt kültenyészetben is megfigyelhető a növekvő homozigótaság. Egyensúlyban lévő zárt tenyészetben az egyedek fele heterozigóta (AB), másik fele homozigóta (25% AA, ill. 25% BB) Rokontenyésztés:4 nemzedéken belüli közös ős a családfában Beltenyésztés:szigorú rokontenyésztés: sorozatos testvér-testvér, gyermek-szülő pároztatás növekvő homozigótaság (genetikai sodródás) (AB helyett AA v. BB) Beltenyésztett törzsek létrehozása:>20 nemzedéken át végzett testvér-testvér (szülő-utód) pároztatás  az összes génlokusz 98,4%-a homozigóta (F=98,4%) A beltenyésztett (inbred) törzs egyedeihomozigóták és izogének (azonos genotípusúak).

5. A törzs bármely tagja elfogadja a bármelyik másik azonos nemű tagjából átültetett szöveteket (graft) az izogenitás ellenőrzése bőrtranszplantációval (Silvers-féle körtranszplantáció) Fenntartása: a ritka mutációk miatt testvér-testvér pároztatással.

6. A beltenyésztett rágcsálótörzsek története: Jensen, Loeb, Ehrlich, Tyzzer: spontán egértumorok sorozatos transzplantációval történő fenntartása  többnyire sikertelen (nem eredt meg v. visszafejlődött) Jensen (1903), Loeb (1908):sikeres sorozatos tumorátoltások viszonylagosan beltenyésztett egerekben a tumorokkal szembeni fogékonyság örökletes Little (1914):a tumorrejekció, ill. a fogékonyság több dominánsan öröklődő génen alapul a hisztokompatibilitási gének, a celluláris immunválasz tanulmányozása Rommel, Wright (1906):beltenyésztett tengerimalacok (2-es és 13-as törzs)

7. King (1909):beltenyésztett patkányok (PA, WKA törzsek) Little (1909):beltenyésztett egerek(DBA/1, DBA/2 törzsek) Bagg (1913): BALB/c egértörzs Strong (1920): A, C3H, CBA egértörzsek Little (1921): C57 egértörzsek családja 1920-1930:a leggyakrabban használt egér- és patkánytörzsek kifejlesztése 1929: A Jackson Laboratórium megalapítása (Little)

8. Beltenyésztési depresszió (leromlás): a szaporodási képesség, életképesség, egészség stb. csökkenése Csak az első néhány generációban fordul elő. Oka:a káros recesszív gének homozigótaságaA kialakult törzsben már nem fordul elő. F1 hibridek:két genetikailag különböző beltenyésztett törzs keresztezéséből származó első generáció Minden egyed izogénésheterozigóta mindazon génlokuszokra, amelyekben a két szülői törzs különbözik(= a gének kodomináns öröklődése és kifejeződése).

9. Ha két transzplantációs antigénekben (H Ag) eltérő törzset keresztezünk, az F1-ek mindkét szülő H Ag-jeit kifejezik → ezért az egyik szülői törzstől származó bőrgraftot sem lökik ki, a szülői törzsek viszont kilökik az F1 graftokat.

10. Hibrid „életerő”vagy heterózis:a beltenyésztési depresszióellentétea káros recesszív gének elfedésea kialakuló heterozigótaság miatt. Nevezéktan:Nómenklatúra Bizottság (1952) Törzsnév:1-4 nagybetű Egér: A, AKR, CBA,DBA stb. Patkány: LEW, WAG, BN, PVG stb. Számok csak a korábban elterjedt törzsek esetén engedélyezettek (pl. egér: C3H, C57BL; patkány: F344, AS2, M520)

11. Altörzs: • - a törzs két v. több ágra oszlika 8-19. testvérpároztatás között • - ugyanabban a tenyészetben két párhuzamos vonal genetikailag eltér. • Példák: C57BL/6, C57BL/10; CBA/J, CBA/Ca; A/He, A/J stb. • Alvonal: • - egy másik laboratóriumban történő hosszú tenyésztés • - a törzs bármilyen manipulációja • Altörzs, alvonal neve:törzsnév/altörzs, alvonal szimbólum(ok) történeti sorrendben (a tenyésztő v. a laboratórium nevének rövidítése, ritkán szám: pl. C57BL/10ScSn: Sc=Scott, Sn=Snell

12. Manipulációk:f:dajkaság(foster nursing) egy másik törzsnél:pl. C57BL/10ScSnfC3H. Pl. specifikált patogénmentes (SPF)ntörzsek létrehozása a magzatok méhhel együtt történő eltávolítása és dajkaságban történő felnevelése révén • e:embriótranszfer egy másik törzsbe • h:mesterséges táplálás (hand rearing) • o:ovárium-transzplantáció • p:petesejttárolás(preservation) cseppfolyós nitrogénben • Rövidített törzsnevek: AKR=AK, BALB/c=C, C3H=C3, C57BL=B, C57BL/6=B6, C57BL/10=B10 • F1hibridek elnevezése: (nőstény szülői törzs x hím szülói törzs)F1:(BALB/c x C57BL/6)F1=CB6F1

13. Koizogén törzsek: • Mutáció egyjelentős génlokuszonegy beltenyésztett törzsben egyúj beltenyésztett törzs kialakítása a mutációt hordozó állatokból • Az új törzs csak egyetlen génlokuszban(a mutált génben) különbözik az eredetitől a génmutáció fenotipikus hatása tanulmányozható. • A mutáció betegség alapját képezheti: • Egér: • Anémia:sla gén • Diabétesz és elhízás (obesity): db, ob gének • Anyagcsere-betegségek:his (hisztidinémia), pro (prolinémia) • Vesebetegség:kd gén • Izomsorvadás (dystrophia):dy, dy2J gén

14. Farok (tail) fejlődési rendellenességek:t-allél • Szőrtelen (nude) és tímuszhiányos:nu • Patkány: • Diabetes insipidus:di gene • Szőrtelen (nude) és tímuszhiányos:rnu gén • Bilirubinémia:j gene • Nevezéktan:törzsnév/altörzsnév-mutáns gén neve: • BALB/c/Rij-nu, C57BL/6J-ob • Kongenikus, ill. kongenikus rezisztens törzsek: • - A kívánt gén (D)bejuttatása egy beltenyésztettdonor törzsből (2.)egy másik, (dgénallélű)recipienstörzsbe (1.)keresztezéssel  F1 hibrideklétrehozása; - az F1-ek visszakeresztezéseaz 1. (recipiens) törzsű egerekkel; - a D gént hordozó utódok (Dd) szelekciója és visszakeresztezése 1. egerekkel.

15. Legalább 10-12 visszakeresztezés szükséges  majd egy Dd heterozigóta hím és nőstény pároztatása  ezután egy DD homozigóta hím és nőstény beltenyésztése: az új, kongenikus törzs hordozza a donor D gént, míg az összes egyéb génjei (háttérgének) azonosak a recipiens (1.) törzsével.

16. Kongenikus rezisztens törzsek:a bőr-, ill. tumorgraftok rejekcióját kiváltó antigének génjeinek (MHC) bejuttatása a recipiens törzsbe Nevezéktan:recipienstörzs.donor törzs(gyakran rövid nevekkel): pl. B10.D2 génrecipiens: C57BL/10 (B10) (MHC=H-2b), géndonor: DBA/2 (D2) (MHC=H-2d) kongenikus rezisztens törzs = B10.D2(másik elnevezés: C57BL/10ScSn-H-2d) A B10.D2 (H-2d) törzs kongenikus a B10 (H-2b) törzzsel: csak a H-2 lokuszban térnek el, háttérgénjeik azonosak.A H-2 felfedezése= az egér fő hisztokompatibili-tási komplexe [major histompatibilitycomplex (MHC)] H-2 kongenikus törzsek közöttitranszplantáció: az MHCfelelős a graftrejekcióért.

17. Rekombináns törzsek:két nem rokon beltenyésztett törzskeresztezésével létrehozott F2generációból származnak, >20 generáción át végzett testvér-testvér pároztatással állítják elő őket. Elnevezés: BALB/c (C) x C57BL/6 (B6)  CXBvonalak Mindkét ős génjeit hordozzák randomeloszlásban. Poligénestulajdonságok tanulmányozására alkamasak: pl. élettartam, morfológiai és fiziológiai jellemzők, betegségek, viselkedés, gyógyszerhatások stb.

18. Transzgenikusállatok: - idegen DNS-szekvenciák = transzgének bejuttatásamegtermékenyített petesejtek pronukleuszaiba - a petesejt bejuttatása álterhes nőstények petevezetékébe - a transzgént kifejező transzgenikus állatok kiválasztása és homozigóta vonal kitenyésztése. A transzgéneketki lehet fejeztetni: -meghatározott szövetekbena megfelelő regulátoros szekvenciákhoz való kapcsolás révén (pl. antigénreceptor-gének lymphocytákban) - gyógyszerekre v. hormonokra (pl. tetraciklin, ösztrogén) válaszoló promoterekhez kapcsolva

19. A transzgenikusállatokat lehet használni: - a transzgén élettani, patológiai hatásainak vizsgálatára; - betegségmodellként; - transzgenikus fehérjék/peptidek (gyógyszerek, hormonok stb.) nagy mennyiségben történő előállítására. Génkiütött állatok: Gének célzott mutációja v. szétrombolása homológ rekombináció révén:a kiütésre használt működésképtelen exogén génkonstrukció az endogén génnel homológ szekvenciákat tartalmaz  rekombináció  a kódoló szekvenciák diszrupciója a génexpresszió és/vagy -funkció megszűnése, deléciója A génfunkció in vivo tanulmányozása

21. Klónozott állatok: Klón: az utód genomja teljesen azonos a kiinduló egyedével. Sejtosztódások (pl. megtermékenyített petesejtek és testi sejtek osztódása  a kiinduló sejt klónjai) Többsejtű élőlények klónozása: I. Embrióosztási technika: Rutin módszer a jó tulajdonságokkal rendelkező háziállatok klónozására(pl. szarvasmarha). Mesterségesenegypetéjű ikreket állítanak elő. Lépések: 1. Egy petesejtet mesterségesen megtermékenyítenek spermiummmal. 2. A zigótát hagyják osztódni 8-sejtes embrióvá.

22. 3. Az embriót 2 x 4-sejtes v. leggyakrabban 4 x 2- sejtes darabokra osztják. A sejtek még nem differenciálódnak a 8-sejtes embrióban  a szétválasztott embriók genetikailag azonosak, mint az egypetéjű ikrek: ikerkészítés embrióból. 4. A szétválasztott embriókat hagyják fejlődni in vitro. 5. Azután beültetik őket egy álterhes nőstény méhébe.

23. II. Testi sejtmag átvitele [somatic cell nuclear transfer (SCNT)] Ian Wilmut és Keith Campbell, Roslin Intézet, Skócia, 1997: a Dolly bárány létrehozása Az SCNT-hez két sejt szükséges:a magdonor testi sejt + egy megtermékenyítetlen petesejtmint recipiens sejt: - A petesejt megfelelőbb recipiens sejt, mint a testi sejtek: könnyebb osztódásra késztetni. - megtermékenyítetlen petesejt könnyebben befogadja a sejtmagot, mint a megtermékenyített. Az SCNT lépései (the Roslin-technika): 1. A donorsejtet (a Dolly esetében emlőmirigysejt) fötális borjúsavót tartalmazó tápfolyadékban tenyésztik, és hagyják osztódni in vitro.

24. 2. Ezután a sejteket FCS-mentes tápfolyadékba helyezik  az osztódás leáll, és a sejtek G0 v. nyugalmi állapotba kerülnek. Ez szükséges, hogy a recipens sejt befogadja a donormagot. 3. A sejtmagot eltávolítjáka petesejtből. 4. A donorsejtet a mag nélküli recipens sejt közelébe helyezik. 5. 1-8 órával a mageltávolítás után  elektromos inger: - donorsejt (v. izolált mag) fúziója a mag nélküli petesejttel; - a sejtosztódás aktivációja és az embrió fejlődése

25. A differenciált donorsejt genetikai programja lenullázódik a petesejtben  differenciálatlan, pluripotens sejt 6. Az embriót birka-petevezetékbe helyezik 5-6 napra (itt az embriók túlélése jobb, mint szövettenyészetben). 7. Amikor az embrió eléri a blasztoméra állapotot (kb. 100 sejt), az embriót beültetik egy dajka anya méhébe. 8. Az anya kihordja a terhességet. Az utódok a donor genetikailag pontos másolatai  reproduktív klónozás A blasztomérákatőssejtforrásként is lehet használni.

26. Honolulu-technika:egerek sikeres klónozása A klónozott állatok képesek voltak normálisan szaporodni, fenntartani a klónt szexuális reprodukció révén. Kromatintranszfer: A klónozandó sejtek kezelése eltávolítja a sejtdifferenciálódással kapcsolatos molekulákat, mielőtt a magot eltávolítják  a genetikai program lenullázódása könnyebben megyvégbe.