1 / 63

Transzgenikus technológia a vesekutatásban

Transzgenikus technológia a vesekutatásban. Mivel foglalkozik a molekul ár is biológia? G-C A-T G-C C-G T-A Élő szervezet G-C G-C T-A C-G. Non-homolog rekombináció “Transzgenikus technológia”.

osric
Télécharger la présentation

Transzgenikus technológia a vesekutatásban

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. Transzgenikus technológia a vesekutatásban

  2. Mivel foglalkozik a molekuláris biológia? G-C A-T G-C C-G T-A Élő szervezet G-C G-C T-A C-G

  3. Non-homolog rekombináció“Transzgenikus technológia” • Jaenisch és Mintz 1974: SV40 DNS egér blasztocisztába • In vivo • endogen gén fokozott expressziója • exogen gén expressziója • genetikus szabályozó régiók vizsgálata (riporter gén) • therápiás szerek, eljárások kipróbálása

  4. Mi befolyásolja a transzgén expresszióját? • integrálódott konstrukt-ok száma (nem lineáris) • integrálódás helye a genomban (random) • prokaryota vektor szekvenciák • transzgén methylálás • alkalmazott egértörzs • indukálható promoterek

  5. A transzgén konstrukt megtervezése, elkészítése • a transzgén és a háttértörzs kiválasztása • a szabályozó régiók megtervezése (enhancer, promoter, Cre/loxP-és flp/FRT rendszer) • a konstrukt elkészítése, klónozása • a konstrukt szekvenálása, restrikciós térképének elkészítése • a konstrukt és a szabályozó régiók in vitro tesztelése • a konstrukt tisztítása a mikroinjektáláshoz

  6. A transzgén bevitele (az oocita mikroinjektálása illetve ES elektroporációja) • hiperovuláltatott nöstényekből oocita gyűjtés • mikroinjektálás az oocitába • embrionális őssejtek (ES sejtek) elektroporációja a konstrukttal • embrionális őssejtek mikroinjekciója a blasztocisztába • az injektált oocita vagy blasztociszta implantálása álterhes nöstényekbe (embrio transzfer)

  7. A transzgenikus utódok verifikálása • az utódok genotipizálása (Southern blot, PCR) • az alapítók (founder) kiválasztása és továbbtenyésztése • az egyes alapítóvonalak karakterizálása • a transzgén müködésének vizsgálata (expresszió) • transzgén kópiaszám meghatározása • teljes szövettani feldolgozás (fény-és EM vizsg., speciális festések) • laboratóriumi vizsgálatok (vérkép, szérum, vizelet) • túlélési görbe, súlygyarapodás, neurológiai vizsgálat • a transzgén várt hatásának vizsgálata

  8. A transzgén sejtspecifikus expressziója • Sejttípus Promóter Referencia • tubuláris epithel sejt 1-alpha hidroxiláz Zehner 1999 • interstitiális sejtek erythropoietin Maxwell 1993 • endothel, mesangium preproendothelin-1 Harats 1995 • podocyta nephrin Moeller 2000 • JGA renin Gross 1990 • Glomerulus, tubulus SV40 Herrup 1991 • Disztális tubulus keratin 18 Oshima 1993

  9. Indukálható transzgenikus rendszer I.

  10. Indukálható transzgenikus rendszer II.

  11. Tamoxifen indukálható Cre-rekombináz ösztrogén-receptor fúziós fehérje promóter Cre rekombináz ET-R transcriptio Inaktív Cre-ösztrogén receptor fúziós fehérje Tamoxifen loxP loxP Aktív Cre rekombináz

  12. Nincs IFN Nincs transzkripció MX promoter Cre rekombináz IFN Transzkripció MX promoter Cre rekombináz Aktív Cre rekombináz loxP loxP 2.Ábra IFN indukálható Cre rekombináz (MX mice)

  13. pBSII SK(+) hGH polyA pDNR-EGFP PCR amplifikált RT-PCR amplifikált Promoter régió Smad7 STOP STOP Promoter régió Smad7 hGH polyA EGFP Cre excisio 4. Ábra EGFP SMAD7 konstrukt Promoter régió Smad7 hGH polyA

  14. Vérnyomás szabályozás vizsgálata • Gén Fenotípus Referencia • Bradikinin B2 rec.(T) hypotenzió Wang 1997 • Bradikinin B2 rec. (KO) hypertenzió Alfie 1996 • Kallikrein kötö protein (T) hypotenzió Chen 1996 • Atrial NP (T) hypotenzió Veress 1995 • Angiotenzin (T) hypertenzió Kimura 1992 • Angiotenzin (KO) hypotenzió Nagata 1996 • Renin (T) hypertenzió Springate 1997

  15. Glomeruláris betegségek vizsgálata • Gén fenotípus referencia • GHRF mezangioszklerózis Doi 1991 • HGF progresszív GN Takayama 1997 • TGF-alfa mezangiális proliferáció Lowden 1994 • TGF-beta1 GS, matrix expanzió Mózes 1999 • Interleukin-4 immunkomplex GN Erb 1997 • Endothelin-1 glomerulonephritis Hocher 1997 • Prorenin renovaszkuláris eltérés Veniant 1996 • HIV-1 FSGS Dickie 1991

  16. Humán genom -Egér genom • 3.109 bp 35000gén (1.5%) • A transzkriptum 70-80%-a ncRNS • A fehérjét kódoló szekvenciák transzkriptumának 95%-a intron • Emberek között 6.106 (0.1%) szekvencia eltérés • Csak 2.104 eltérés van fehérje kódoló régióba • Az eltérések 99.7%-a fehérjét nem kódoló szakaszokon • Humán gének 95% ának megvan az egér ekvivalense

  17. TGF-ß jelentősége a vesefibrózisban primer betegség (hipertónia, diabétesz, stb.) nefron szám csökkenése hiperfiltráció glomerulus hipertrófia shear stress endothel aktiváció podocita hipertrófia, aktiváció és apoptózis albuminuria TGF-ß TGF-ß glomeruloszklerózis tubulus toxicitás TGF-ß tubulointerstíciális gyulladás és fibrózis vesefibrózis

  18. TGF-ß transzgenikus egérmodell • TGF-ß1 transzgenikus egér: • Albumin promóterhez teljes sertés TGF-ß1 cDNS az Y kromoszómán (S. Thorgeirsson, NIH, USA) [1] • Májban termelődik a születés után, magas keringő aktív TGFß1 szint • Transzgént C57BL6xCBA (F1) zigótába injektálták, fenntartás F2 nemzedékek F1-el való visszakeresztezésével • Az F2,F3,Fn nemzedékekben (inhomogén genetikai háttér) kétféle fenotípus, azonos keringő TGF-ß szint mellett: [2] • - enyhe vesefibrózis • - nagyon súlyos vesefibrózis, korai halál • [1] Proc Nat Acad Sci USA 1995(92):2572-2576 • [2] J Am Soc Nephrol 1999; 10:271

  19. Hipotézis és célkitűzés • Hipotézisünk szerint a genetikai háttérnek meghatározó szerepe van a TGF-ß indukált vesefibrózis progressziójában • Célunk: • Vesefibrózis genetikai háttértől függő molekuláris mechanizmusának megismerése • Összefüggés keresése a progresszió, a genetikai háttér és a vizsgált molekuláris mechanizmusok között

  20. Metodika I. B6 CBA CBAxB6 (F1) B6- TGFß CBA CBAxB6-TGFß (F1) • Az F2,F3, Fn nemzedék genetikai inhomogenitásának kizárása: • a TGF-ß1 transzgént visszakereszteztük C57Bl6 (B6) beltenyésztett • egértörzsre (B6-TGFß egerek, több mint 20 nemzedék (N22, 99.999%)). • - vizsgáltuk az egerek túlélését, a vesék szövettanát • Genetikai háttér szerepének bizonyítása: • - B6-TGFß egerek keresztezése CBA egerekkel (CBAxB6-TGFß F1) • - CBAxB6-TGFß F1 hibrideket összehasonlítása B6-TGFß egerekkel • - kontrollként nem transzgenikus B6 ill. CBAxB6 F1 egereket használtunk. • Kísérleti csoportok (n=6-10/csoport): • 1) B6 • 2) B6-TGFß • 3) CBAxB6 (F1) • 4) CBAxB6-TGFß (F1)

  21. Nemzedékek és genetikai azonosság

  22. TGF-ß transzgén Mikroinjektált TGFß transzgén cDNS felépítése Cys223→Ser; Cys225→Ser: aktív TGFß szintézis

  23. Metodika II. • Elvégzett vizsgálatok: • Túlélés • Keringő TGF-ß szint (plazma) • Vizelet protein/kreatinin hányados • Vese szövettan • glomeruloszklerózis, tubulointerstíciális fibrózis • fibronektin immunhisztokémia • mRNS expresszió vizsgálata vesében • TGFß, CTGF, kollagén-III, decorin, biglycan, MMP, TIMP, Smad • Statisztika: Log-rank teszt, ANOVA, Kruskal-Wallis teszt (SPSS 10)

  24. Survival of B6-TGFß and CBAxB6-TGFß mice • CBAxB6-TGFß: 60% túlélés 2 hetes korban • B6-TGFß: 100% túlélés 2 hetes korban mintavétel 14 napos korban

  25. Testtömeg 14 napos korban 10 9 8 7 6 body weight (g) 5 4 3 2 1 0 B6 B6-TGFß CBAxB6 CBAxB6-TGFß n=8-14/csoport, ns. (ANOVA)

  26. Vesesúly 14 napos korban 0.012 0.010 0.008 0.006 g kidney wt / g body wt 0.004 0.002 0.000 B6 B6-TGFß CBAxB6 CBAxB6-TGFß n=8-14/csoport, ns. (ANOVA)

  27. Liver vanGieson stain n=6/csoport, * p<0.01 vs CBAxB6-TGFß (Kruskal-Wallis)

  28. 4-5x plazma TGF-ß1 szint emelkedés a transzgenikus állatokban 80 * 70 # 60 50 ng/mL 40 30 20 10 0 B6 B6-TGFß CBAxB6 CBAxB6-TGFß n=10/csoport, * p<0.01 vs B6, # p<0.05 vs CBAxB6 (Kruskal-Wallis)

  29. Vizelet protein/kreatinin hányados 2x emelkedése CBAxB6-TGFß egerekben 16 14 # * 12 10 8 mg prot/mg crea 6 4 2 0 B6 B6-TGFß CBA-B6 CBAxB6-TGFß n=8/csoport, * p<0.001 vs B6-TGFß, # p<0.01 vs CBAxB6 (Kruskal-Wallis)

  30. * * * Serum urea értékek n=5/csoport, * p<0.05 vs CBAxB6-TGFß (ANOVA)

  31. Vesefibrózis kizárólag CBAxB6-TGFß egerekben *# *# B6 B6-TGFß CBAxB6 CBAxB6-TGFß n=10/csoport, *p<0,01 vs B6-TGFß, #p<0,01 vs CBAxB6 (Kruskal-Wallis)

  32. Fokozott fibronektin termelés CBAxB6-TGFß egerekben *# B6 B6-TGFß CBAxB6 CBAxB6-TGFß n=6/csoport, * p<0.0001 vs B6-TGFß, # p<0.001 vs CBAxB6 (Kruskal-Wallis)

  33. CBAxB6-TGFß egerekben magasabb a vese kollagén-III mRNS expressziója n=7/csoport, * p<0.05 vs CBAxB6-TGFß (Kruskal-Wallis)

  34. CBAxB6-TGFß egerekben megemelkedik a vese endogén TGF-ß mRNS expressziója n=7/csoport, * p<0.05 vs CBAxB6-TGFß (Kruskal-Wallis)

  35. Nincs szignifikáns különbség a biglycan és decorin mRNS expressziójában Biglycan Decorin n=7/csoport, ns. (Kruskal-Wallis)

  36. Smad3 Smad4 Smad7 n.s. n.s. n.s. Nincs különbség a Smad3, Smad4 és Smad 7 mRNS expressziójában n=7/csoport, n.s. (Kruskal-Wallis)

  37. 90x TIMP-1 mRNS expresszió emelkedés CBAxB6-TGFß egerek veséjében n=7/csoport, * p<0.001 vs CBAxB6-TGFß (Kruskal-Wallis)

  38. TIMP1 / MMP9 TIMP1 / MMP2 TIMP-1 és mátrix metalloproteinázok mRNS expressziójának aránya n=7/csoport, * p<0.01 vs CBAxB6-TGFß (Kruskal-Wallis)

  39. ÖSSZEFOGLALÁS • B6-TGFß egerekhez képestaCBAxB6-TGFß egerekben: • Változatlanul magas plazma TGF-ß szint • Túlélés drámaian lerövidül • Vesefibrózis mértéke korrelál a túléléssel • Renális TGF-ß mRNS expresszió kétszeresére nőtt • Nincs különbség a decorin és biglycan expressziójában • Drámaian nőtt a TIMP-1 mRNS expresszió

  40. TIMP-1 szerepe a TGF-ß indukált vesefibrózisban Magas keringő TGF-ß szint Genetikai háttér Vesefibrózis iniciálása TIMP-1 expresszió Lassú progresszió (B6 egerek) TIMP-1 Gyors progresszió (CBAxB6 egerek) TIMP-1

  41. KÖVETKEZTETÉS • Modellünkben a genetikai háttér alapvetően • befolyásolja a keringő TGF-ß profibrotikus • hatását. • Vizsgálataink során összefüggést találtunk a • vesefibrózis progressziója, a genetikai háttér és • a TIMP-1 mRNS expressziója között. • Modellünkben a C57Bl6 egértörzs alacsony • TIMP-1 expressziója magyarázza a • vesefibrózissal szembeni rezisztenciát.

  42. Survival of TGF-ß tg strains

  43. TGF-beta1 transzgenikus egerek • Konstrukt: 4.7kb • Egér albumin promoter/enhancer • Sertés TGF-beta1, (2 cystein szerinre változtatva) • 3’ vége a hGH (poly-A signal) • A transzgén az Y kromoszómán van • (C57BL6 x CBA) F1 háttér • F1 háttérre folyamatosan visszakeresztezték • Progresszív vesefibrózis, urémia • 15 hetes korra 25% mortalitás

  44. Kettős fenotípus TGF-beta 1 TG egerekben

  45. A TGF-beta1 TG egerek visszakeresztezése • C57BL6 beltenyészett háttér • 10 generáció (két év) • 99.9% homogén genetikai háttér • Változatlan TGF-beta1 plazma szint • Megszünt a kettös fenotípus • Túlélés meghaladja az egy évet

  46. F1 generáció létrehozása • Hím C57BL6 TG Hím C57BL6 WT • Nöstény C57BL6 C57BL6 TG C57BL6 WT • Nöstény CBA (CBA/C57BL6)F1 TG (CBA/C57BL6)F1 WT • Nöstény FVB/N (FVBN/C57BL6)F1 TG (FVBN/C57BL6)F1 WT • Nöstény BalbC (BalbC/C57BL6)F1 TG (BalbC/C57BL6)F1 WT

  47. Elözetes eredmények • Mindhárom hibrid törzsben súlyos fibrózis alakul ki • A C57BL6 törzsben létezik olyan genetikai faktor, amely meggátolja a TGF-beta indukálta fibrózis progresszióját • Célunk ennek a faktornak az azonosítása

More Related