Regulación de la Expresión Genética Mediante RNA: Interferencia por RNA (RNA Interference), Ribozimas y Aptámeros

1. Regulación de la Expresión Genética Mediante RNA: Interferencia por RNA (RNA Interference), Ribozimas y Aptámeros Oscar N. Ruiz, Ph.D. Curso: BIOT 3250 Universidad Interamericana de Puerto Rico, Recinto de Bayamon

2. A. Objetivos • Entender los mecanismos de silenciamiento y regulación de genes controlados por RNA. • Comprender los conceptos que permiten la aplicación de la regulación mediante RNA a la biotecnología moderna. • Aplicar los conceptos de la regulación de expresión mediante RNA para el desarrollo de agentes terapéuticos.

3. B. Conceptos Previos • Transcripción • Promotor y Terminador • Estructura secundaria del RNA • Modificaciones Post-transcripcionales • RNA Splicing : separacion del RNA • RNA Editing: cambios de nucleotidos para favorecer codones abundantes • Regulacion de la expression: • Eucariota: transcripcional, post-transcripcional y traduccional • Procariota: transcripcional

4. C. Pertinencia del Tema • Nuevas terapias son requeridas para contrarrestar: • Enfermedades bacterianas • MRSA: “methicillin-resistant S. aureus” (www.cdc.gov) • Enfermedades virales • VIH: Retrovirales (inhibidores de proteasa y inhibidores de retro-transcripción) • Fiebre aviar (Avian Flu) • Enfermedades genéticas • Cáncer: gen p53 (Brummelkamp et al., 2002) • Desarrollo de organismos modelos • Estudios de función de los genes mediante “gene knockdown”

5. D. Marco Conceptual • Interferencia por RNA o RNA interference (RNAi): la inhibición especifica de la expresión de genes mediante dsRNA (Fire, 1999). • RNAi es un mecanismo conservado en eucariotas: • Protege contra: • RNAs exogenos: viruses • Transposones: elementos móviles y repetitivos • Regulación post-transcripcional • Genes del desarrollo

6. Aplicaciones biotecnológicas: • Permite el análisis proteomico a gran escala • Se está convirtiendo en una tecnología muy prometedora para el desarrollo de agentes terapéuticos (Santel et al., 2006) . • Gran especificidad • Bajos efectos secundarios • No se conoce resistencia • Desarrollo de organismos modelos para enfermedades humanas.

7. RNAi en la Célula Shi et al., 2002

8. Mecanismo del RNAi • En animales RNAi requiere múltiples pasos: • Generación de siRNAs a partir de dsRNAs largos • Rnase III-like endonuclease (Dicer) • Degradación de RNA complementario mediante el complejo siRNA-RISC (RNA-induced silencing complex) (Hannon, 2002). www.rnaiweb.com/RNAi/What_is_RNAi

9. El mecanismo de RNAi es bien conservado pero con características diferentes en cada organismo: • C. elegans: ocurre la amplificación y conversión de ssRNA a dsRNA • RNA-dependent RNA polymerase • Este dsRNA es substrato para mas RNAi mediante (Ahlquist, 2002). • C. elegans: se ha observado el esparcimiento de RNAi de una célula a otra: • Efecto sistémico • Transportador específico de siRNA en la membrana celular (Winston et al., 2002). • ORFs similares a los de C. elengans en humanos y en ratones pero . park.itc.u-tokyo.ac.jp/mgrl/IINO_lab/g2_molgenet2.html

10. RNA polimerasa dependiente de RNA “RNA-dependent RNA polymerase”

11. En C. elegans and Drosophila: • siRNA se deriva de dsRNA largos. • En las células mamíferas: • dsRNA mayores de 29 nt producen la activación de la “dsRNA-dependent protein kinase (PKR)” (Stark et al., 1998; Schiffelers et al., 2004) • Produce la inhibición generalizada de la transducción e induce a la apoptosis (Gil, 2000). • Dicer tiene baja actividad en el procesamiento de dsRNA largos in vivo • Acumulación de dsRNA (Brummelkamp et al., 2002). • Activa la respuesta tipo 1 mediada por inteferón • “STAT-mediated expression of PKR”. • signal transducer and activator of transcription 1 (91kDa) • dsRNA se une a PKR directamente y la activa • Ocurre fosforilacion del factor de iniciación eucariota (global shutdown of translation). • dsRNA promueve la síntesis de acido poliadenílico “polyadenylic acid” • Activa a Rnase L http://www.ambion.com/techlib/resources/RNAi/

12. fig.cox.miami.edu/~cmallery/.../how_siRNA_works.htm www.biovalley.fr/francais/.../collec_shrna_pour_rnai.htm

13. Estatus de la Tecnología • Producción de siRNA por síntesis química • Beneficios: • Muy específicos • Síntesis a gran escala es posible • Problemas: • Se necesita suplir el siRNA de forma continua • Su síntesis es costosa • Se necesitan con alta pureza y concentración • estudios in vivo necesitan altas concentraciones. • Es necesaria la utilización de lisosomas y compuestos poli-cationicos para envío.

14. Producción de siRNA mediante vectores plásmidos: Se Pueden utilizar el promotor de la RNA polimerasa III: • contiene todos los elementos de transcripción contenidos de forma compact • La RNA polimerasa III esta envuelta en la producción de micro-RNA celulares y produce una extensión de 2 nt. • Permite expresión por periodos mas prolongados • Alta expresión y costos mas bajos

15. Problemas: • Expresión temporera del siRNA • Eficiencia de la transfección es muy baja especialmente in vivo.

16. Para resolver algunos de los problemas encontrados se han utilizado vectores virales incluyendo: retroviruses, lentiviruses, and adeno-associated viruses: • Herramienta muy efectiva para la producción de siRNAs en células (Brummelkamp et al., 2002; Haasnoot et al., 2004; Zhang et al., 2004) • Expresión estable y constitutiva • Alta transferencia del transgene

17. Desventajas: • Retroviruses han causado efectos adversos en estudios clínicos. • Limita la aplicación de este sistema y otros sistemas de integración al azar como métodos de expresión de siRNA en el futuro cercano (Recchia et al., 2006). • Posibilidad de contaminación con virus viables. • Capacidad limitada para utilización in vivo en humanos: • Tropismo del virus es limitado • Es trabajoso seleccionar las células transfectadas.

18. Enfermedades humanas en estado avanzado requieren expresión del siRNA en múltiples tejidos o en el cuerpo completo. • De manera alternativa, se podría inyectar siRNA sintetizados in vitro o químicamente cubiertos por liposomas (Santel et al., 2006). • Mas seguro • Requiere altas concentraciones del siRNA • Es muy costoso

19. G. Resumen La tecnología del RNAi ha demostrado gran potencial RNAi in vitro and in vivo (Fraser et al., 2000; Lewis et al., 2002) • Grandes aplicaciones terapéuticas • RNAi ha logrado la reducción de la expresión de proteínas en sobre un 90%. • Múltiples genes han logrado ser silenciados: • Genes reporteros • Genes virales (HIV proteins vif, nef and LTRs) • Oncogenes (p53)

20. Problemas que limitan el uso de RNAi como agentes terapéuticos en humanos: (Uprichard 2005). • Mecanismos de envío • siRNA (small interference RNA) de tamaño específico 19-23 nt • Efecto transitorio • Síntesis costosa

21. D. Marco Conceptual: Aptámero • Oligonucleótidos de RNA o DNA que producen estructuras secundarias tridimensionales con especificidad por otras moléculas • SELEX: Evolución sistemática de ligándos por enriquecimiento exponencial “Systematic evolution of ligand by exponential enrichment” • Biblioteca de 1 x1014-1015 http://www.devicelink.com/ivdt/archive/07/05/010.html

22. E. Ventajas y Aplicaciones • Macugen (OSI Pharmaceuticals): aptamero inhibe el “antivascular endothelial growth factor” que participa en el crecimiento de vasos sanguíneos en el ojo. • Aprobado por el FDA para tratar degeneración macular neovascular. • ARC183 (Gilead) : aptamero anti-trombina que inhibe la coagulación fisiológica de la sangre. • Aprobado en fase clínica I

23. Riboenzimas “Ribozymes” • Riboenzimas: RNA con capacidad catalítica que cortan otras moléculas de RNA. • Cortan su propia secuencia • Cortan secuencias en otros RNA • Muchas contienen Mg+2 como cofactor • Dos regiones: • Catalítica • Secuencia de reconocimiento Pley, H.W., Flaherty, K.M. and McKay, D.B. (1994) Three-Dimensional Structure of a Hammerhead Ribozyme. Nature 372, 68-74.

24. E. Aplicaciones • Ribozima anti-hepatitis B (PennStateCollege of Medicine): Destruye hasta el 80% del virus en el hígado del ratón. • Es el único mecanismo in vivo que ha demostrado la reducción del virus de la hepatitis B.