‘’ Docking and Assembly of the Type II Secretion Complex of Vibrio cholerae ’’

1. ‘’Docking and Assembly of the Type II SecretionComplex of Vibrio cholerae’’ Journal of Bacteriology (2009) Lybarger et al Bressuire Christelle

2. INTRODUCTION Le Système de sécrétion de type II • - Mécanisme en 2 étapes • Translocation MI via Sec ou Tat • Machinerie complexe similaire machinerie d’assemblage Pili type IV • Translocation ME de la conformation repliée

3. INTRODUCTION Vibrio cholerae • Bacille incurvé Gram – • Responsable du cholera • Sécrétion de toxine et de facteurs de virulence par SST2

4. INTRODUCTION Modèle du Système de sécrétion de type II de Vibrio cholerae

5. INTRODUCTION Modèle du Système de sécrétion de type II de Vibrio cholerae

6. INTRODUCTION Modèle du Système de sécrétion de type II de Vibrio cholerae

7. INTRODUCTION Modèle du Système de sécrétion de type II de Vibrio cholerae Comment s’assemble le SST2 dans la paroi de Vibrio cholerae ?

8. INTRODUCTION Interactions protéine-protéine du SST2 C Assemblage du SST2 ? Etude interactions protéine-protéine

9. INTRODUCTION Interactions protéine-protéine du SST2 C Assemblage du SST2 ? Etude interactions protéine-protéine GspC GspD

10. INTRODUCTION Interactions protéine-protéine du SST2 C Assemblage du SST2 ? Etude interactions protéine-protéine GspC GspD Gsp C GspM et GspL

11. INTRODUCTION Interactions protéine-protéine du SST2 C Assemblage du SST2 ? Etude interactions protéine-protéine GspC GspD EpsL EpsM Gsp C GspM et GspL

12. INTRODUCTION Interactions protéine-protéine du SST2 C Etude de l’assemblage du SST2 de Vibrio cholerae Etude des interactions protéine-protéine de EpsC et EpsM Suivit des protéines GFP-EpsC et GFP-EpsM in vivo Protéine GFP (Green Fluorescent Protein)

13. Localisation polaire de GFP-EpsM • Directed polar secretion of protease from single cells of Vibrio cholerae via the type II secretion Pathway. Scott et al. PNAS (2001) • Green fluorescent chimeras indicate nonpolar localization of pullulanase secreton components PulL and PulM. Buddelmeijer et al. J. Bacteriol (2006) GFP-EpsM localisé aux pôles de la bactérie Vibrio cholerae GFP-PulM non surproduit n’est pas localisé aux pôles de la bactérie Klebsiella Oxytoca

14. Localisation polaire de GFP-EpsM • Directed polar secretion of protease from single cells of Vibrio cholerae via the type II secretion Pathway. Scott et al. PNAS (2001) • Green fluorescent chimeras indicate nonpolar localization of pullulanase secreton components PulL and PulM. Buddelmeijer et al. J. Bacteriol (2006) GFP-EpsM localisé aux pôles de la bactérie Vibrio cholerae GFP-PulM non surproduit n’est pas localisé aux pôles de la bactérie Klebsiella Oxytoca La localisation polaire de GFP-EpsM est-elle due à la surproduction de la protéine?

15. Localisation de GFP-EpsM ? Souche Vibrio cholerae ∆epsM + pGfp-EpsM

16. Localisation de GFP-EpsM ? • Observation au microscope à fluorescence C Induction à l’IPTG Localisation des protéines GFP-EpsM aux pôles de la bactérie

17. Localisation de GFP-EpsM ? • Observation au microscope à fluorescence C Sans induction à l’IPTG Localisation des protéines GFP-EpsM à la périphérie de la membrane

18. Localisation de GFP-EpsM ? • Observation au microscope à fluorescence + IPTG - IPTG La Localisation polaire de GFP-EpsM est due à l’induction à l’IPTG

19. Localisation de GFP-EpsM ? • Observation au microscope à fluorescence + IPTG - IPTG Artefact !!! La Localisation polaire de GFP-EpsM est due à la surproduction de la protéine.

20. Localisation polaire de GFP-EpsM= Surproduction protéines? C Surproduction des protéines GFP-EpsM les protéines GFP-EpsM sont localiseés aux pôles de la bactérie Hypothèse 1: la surproduction des protéines GFP-EpsM Hypothèse 2: les protéines GFP-EpsM sont surproduites alors que les autres protéines du SST2 ne le sont pas

21. Hypothèse 1 ou 2? Souche Vibrio cholerae Gfp-EpsM

22. Hypothèse 1 ou 2? C C Souche Vibrio cholerae ∆epsM + pGfp-EpsM Souche Vibrio cholerae Gfp-EpsM Promoteur Inductible = Protéine GFP-EpsM peut être produite à un niveau différent de celui des autres protéine Eps Promoteur eps = Protéine GFP-EpsM produite en adéquation avec les autres protéines Eps

23. Protéine GFP-Eps = Protéine native Eps? C ? Localisation protéines GFP-EpsC et GFP-EpsM Localisation protéine native EpsC ou EpsM ? SST2 assure la sécrétion des toxines de Vibrio cholerae

24. Vérification production protéine de fusion par Western-Blot Détection protéine GFP-EpsM Protéine GFP –EpsM instable ? ‘’Cross reactive band’’ ? Détection de protéine GFP-EpsC

25. Le SST2 des souches GFP-EpsC et GFP-EpsM est il toujours fonctionnelle ? Induction IPTG protéaseVC1200 Methylcoumarin fluorescent BOC

26. Le SST2 des souches GFP-EpsC et GFP-EpsM est il toujours fonctionnelle ? L’insertion de la fusion GFP n’empêche pas le fonctionnement du SST2

27. Localisation des protéines de fusion GFP-EpsC et GFP-EpsM • Observation au microscope à fluorescence Protéine de fusion localisé dans la membrane de Vibrio cholerae et non aux pôles

28. Localisation polaire de GFP-EpsM= Surproduction protéines? C Surproduction des protéines GFP-EpsM les protéines GFP-EpsM sont localisés aux pôles de la bactérie Hypothèse 1: la surproduction des protéines GFP-EpsM Hypothèse 2: les protéines GFP-EpsM sont surproduit alors que les autres protéines du SST2 ne le sont pas

29. Localisation polaire de GFP-EpsM= Surproduction protéines? C Surproduction des protéines GFP-EpsM les protéines GFP-EpsM sont localisés aux pôles de la bactérie Hypothèse 1: la surproduction des protéines GFP-EpsM Hypothèse 2: les protéines GFP-EpsM sont surproduit alors que les autres protéines du SST2 ne le sont pas La stœchiométrie des protéines de fusion et des autre Eps est nécessaire à la localisation des protéines de fusions

30. Localisation des protéines de fusion GFP-EpsC et GFP-EpsM • Observation au microscope à fluorescence ? Points de fluorescence= SST2 assemblé

31. Point de fluorescence = SST2 assemblé? • Observation au microscope à fluorescence C Dispersion de la fluorescence Compétition Protéine native Eps / Protéine GFP-Eps Point de fluorescence = SST2 assemblé

32. Vérification de l’importance du maintien de la stœchiométrie des Eps pour la localisation des protéines C Souche Vibrio cholerae PBAD Remplacement epsC et epsM par leur version fusionnée gfp-epsM et gfp-epsC sous le contrôle du promoteur pbad inductible à l’arabinose. Maintien équilibre des éléments Eps du T2SS

33. Vérification de l’importance du maintien de la stœchiométrie des Eps pour la localisation des protéines

34. Vérification de l’importance du maintien de la stœchiométrie des Eps pour la localisation des protéines Maintien de la stœchiométrie naturelle de chacun des composants du SST2 = Pré requis pour détermination de la localisation cellulaire

35. Observation au microscope à fluorescence

36. Observation au microscope à fluorescence Le nombre de point de fluorescence augmente avec le niveau d’induction à l’arabinose

37. Corrélation Points de fluorescence/Sécrétion protéase du SST2?

38. Corrélation Points de fluorescence/Sécrétion protéase du SST2? Les points de fluorescence représentent un SST2 fonctionnelle

39. Localisation protéine GFP-EpsC et Eps= Localisation protéine native EpsC et EpsM ? • Localisation protéine EpsG par immunofluorescence

40. Localisation protéine GFP-EpsC et Eps= Localisation protéine native EpsC et EpsM ? Auto-fluorescence Points de fluorescence

41. Localisation protéine GFP-EpsC et Eps= Localisation protéine native EpsC et EpsM ? Auto-fluorescence Points de fluorescence la localisation des protéines de fusion est représentatif des protéines natives

42. Assemblage du Système de sécrétion de type II

43. Ancrage du système de sécrétion de type II de Vibrio cholerae Rôle filaments cytosquelette MreB ? MreB n’est pas nécessaire à l’apparition des points de fluorescence

44. Ancrage du système de sécrétion de type II de Vibrio cholerae Rôle filaments cytosquelette MreB ? MreB n’est pas nécessaire à l’apparition des points de fluorescence L’activité du SST2 ne dépend pas de MreB MreB n’intervient pas dans l’arrimage du SST2

45. Interactions protéine-protéine entre GFP-Eps et les autres Eps Rôle des autres protéines Eps dans la localisation de EpsC et EpsM? C • Délétions des autres gènes Eps • Observation de l’effet de la délétion: • Sur l’expression des gènes • gfp-EpsC et gfp-EpsM • Sur l’activité du SST2 • Sur la localisation des protéines de fusion GFP-EpsC et GfP-EpsM

46. Effet de la délétion des gènes epsD, espL et epsM ? Sur le niveau d’expression?

47. Effet de la délétion des gènes epsD, espL et epsM ? Sur le niveau d’expression? La délétion d’epsD espL et epsM entraine une surproduction des autres protéines Eps

48. Effet de la délétion des gènes epsD, espL et epsM ? Sur le niveau d’expression? C • Augmentation de la production des protéines Eps non due à la fusion GFP • Hypothèse: • Absence Eps D, EpsL ou EpsM • SST2 non fonctionnelle • Suractivation du promoteur eps (facteur σE) • Augmentation de la production des autres protéines Eps

49. Effet de la délétion des gènes epsD, espL et epsM ? Sur l’activité du SST2?

50. Effet de la délétion des gènes epsD, espL et epsM ? Sur l’activité du SST2? La Délétion des gènes epsD, espL et epsM empêche la sécrétion de protéase par le SST2