D ocente: Dr. Stefania Bortoluzzi Dipartimento di Biologia Universita' di Padova

1. Corso di Laurea in Biologia Sanitaria Universita' di PadovaC.I. DI METODI STATISTICI PER LA BIOLOGIA, INFORMATICA E LABORATORIO DI INFORMATICA (MOD. B)8 + 32 ore Docente: Dr. Stefania Bortoluzzi Dipartimento di Biologia Universita' di Padova viale G. Colombo 3, 35131, Padova Tel. 0039 049 8276214 Email: stefibo@bio.unipd.it

2. IV LEZIONE Uso di Genome Browser per l'annotazione di sequenze genomiche. Allineamento di sequenze trascritte con sequenze genomiche: BLAT.

3. PROGETTO GENOMA UMANO Milestones: • 1990: Inizio (U.S. Department of Energy and the National Institutes of Health) • Giugno 2000: Completamento della sequenza “working draft” dell’intero genoma umano • Febbraio 2001: Pubblicazione prime analisi sul genoma completo • Aprile 2003: Completamento della sequenza

4. Una sequenza viene detta “finita” quando presenta un livello di errore inferiore a 1/10000 basi e non ha gaps. Il Progetto Genoma Umano era complesso dal punto di vista tecnico ma anche dal punto di vista computazionale. L’output di una singola reazione di sequenza (read) = 500-800 bp  Tutti i singoli frammenti dovevano essere assemblati in una singola stringa lineare. NCBI fornisce ora l’assembly di riferimento per i 3 principali “portali genomici”: MapView Ensembl Genome Browser

5. La sequenza primaria del genoma non è sufficiente… Annotazione del genoma • E’ necessario riportare sull’assembly le informazioni e i dati sperimentali già ottenuti. • Riconciliare e integrare l’assembly con le mappe fisiche, genetiche e citogenetiche • Gli STS sono mappati sulla sequenza usando e-PCR • La corrispondenza con la mappa citogenetica utilizzando FISH sistematica di BAC. L’annotazione dei geni è attuata con metodi leggermente diversi dai 3 “genome browser” • L’NCBI allinea mRNA di RefSeq, mRNA di GenBank utilizzando MegaBlast. • Ensembl allinea tutte le proteine umane note di SP/Trembl utilizzando un suo algoritmo • UCSC allinea mRNA di Refseq e GenBank e dalle ultime release SP/Trembl con BLAT

6. Annotazione dei geni • ab initio, in base a “sensori”, funzioni che tentano di dedurre la presenza di una caratteristica genica in base a motivi o proprietà statistiche del DNA. • Sensori per TSS (G+C) • Sensori per siti splicing (AG-GT) • Sensori che misurano la composizione in basi di esoni putativi L’output dei vari sensori è combinato per generare un “modello genico” • metodi basati sulla similarità: l’allineamento di una regione genomica con un cDNA o un EST sono una buona evidenza. Lo splicing alternativo complica l’interpretazione degli allineamenti tra DNA genomico, cDNA e ESTs I dati di similarità sono incompleti: trascritti poco espressi o espressi transientemente sono assenti… I programmi di ultima generazione come Grail/Exp, Genie EST, GenomeScan combinano predizioni ab inizio con dati di similarità ottenendo risultati migliori

7. Viral Genomes

18. 3 milioni di basi in formato testo = nessuna utilita’ • Servono: • Annotazione dell’informazione sulla sequenza • Possibilita’ di recuperare velocemente la sequenza di regioni specifiche del genoma in base a criteri di • Contenuto di informazione • Caratteristiche di sequenza • Genomi • disponibili • Human • Homo sapiens assembly • 99% delle regioni contenenti geni • accuratezza 99.99% • 2.84 Gb finite “highly contiguous” • Species • A. gambiae • A. mellifera • C. briggsae • C. elegans • C. intestinalis • Chicken • Chimp • Cow • D. ananassae • D. erecta • D. grimshawi • D. melanogaster • D. mojavensis • D. persimilis • D. pseudoobscura • D. sechellia • D. simulans • D. virilis • UCSC Genome Browser • Sistema per la “navigazione” della sequenza e dell’annotazione di genomi, che permette la visualizzazione dell’informazione a “diverso ingrandimento” ed il recupero di porzioni di sequenza con associate le informazioni di annotazione, come: • Geni noti e geni predetti • ESTs, mRNAs • Isole CpG • assembly gaps e coverage, bande cromosomiche • Omologia con altri genomi • … D. yakuba Dog Fugu Human Mouse Opossum Rat Rhesus S. purpuratus SARS Tetraodon X. tropicalis Yeast Zebrafish

19. UCSC Genome Browser • Molte possibilita’ per la ricerca di una regione specifica: • chr7 un cromosoma intero • 20p13 una regione (banda p13 del cr. 20) • chr3:1-1000000 il primo milione di basi del cr. 3 dal ptel • D16S3046 regione intorno al marcatore (100,000 basi per lato) • RH18061;RH80175 regione tra i due marcatori • AA205474 regione genomica che si allinea con la sequenza con questo GB accession number • PRNP regione del genoma che comprende il gene PRNP • NM_017414 • NP_059110 • 11274 (LLID) • Oppure di liste di regioni: • pseudogene mRNA Lists transcribed pseudogenes, but not cDNAs • homeobox caudal Lists mRNAs for caudal homeobox genes • zinc finger Lists many zinc finger mRNAs • huntington Lists candidate genes associated with Huntington's disease

23. Genome Browser • Categorie di annotazione: • Mapping and Sequencing Tracks • Genes and Gene Prediction Tracks • mRNA and EST Tracks • Expression and Regulation • Comparative Genomics • ENCODE Tracks • Variation and Repeats

24. Known Genes Hide Genome Browser: display mode

25. Known Genes Dense Genome Browser: display mode

26. Known Genes Squish Genome Browser: display mode

27. Known Genes Pack Genome Browser: display mode

28. Known Genes Full Genome Browser: display mode

29. Genome Browser • Categorie di annotazione: Expression and Regulation

30. CpG Islands, ISOLE CpG Regioni in cui seqenze CpG sono significativamente piu’ frequenti che nel resto del genoma. Associate ai geni, soprattutto agli housekeeping. Di solito si trovano vicino ai TSS, associate ai promotori. Nei vertebrati le sequenze CpG sono rare, e le C nelle isole CpG tendono ad essere metilate e, nel tempo, le C metilate tendono a mutare a T per deaminazione spontanea. Percio’ sono rare e di solito “vengono mantenute solo per ragioni regolative”. Metodo: Finestra a scorrimento per dinucleotidi (punteggio +17 per CG, -1 tutti gli altri) e successiva identificazione dei segmenti con punteggi massimali. Poi, per ogni segmento, calcolo contenuto in GC (>= 50%), lunghezza (> 200), e rapporto tra frazione di dinucleotide CG osservato e atteso in base al contenuto in GC del segmento (> 0.6).

31. GNF Gene Expression Atlas Ratios Using Affymetrix GeneChips Dati d’espressione ottenuti dall’analisi di Affymetrix GeneChips GNF (The Genomics Institute of the Novartis Research Foundation). I colori mostrano il segnale medio tra diversi esperimenti su scala logaritmica: colore scuro  segnale forte.

32. FirstEF: First-Exon and Promoter Prediction Predizioni del programma First Exon Finder: primi esoni, promotori e isole CpG. Due predizioni consecutive a distanza inferiore a 1000 bp sono rappresentate come primi esoni alternativi. Metodo: FirstEF is a 5' terminal exon and promoter prediction program. It consists of different discriminant functions structured as a decision tree. The probabilistic models are optimized to find potential first donor sites and CpG-related and non-CpG-related promoter regions based on discriminant analysis.

33. Genome Browser • 5-Way Regulatory Potential • Traccia che mostra il punteggio RP lungo la sequenza in esame, computato in base all’analisi dell’allineamento multiplo di regioni ortologhe dei genomi considerati • Description • This track displays regulatory potential (RP) score, computed from alignments of human (hg17), chimpanzee (panTro1), mouse (mm5), rat (rn3), and dog (canFam1).

34. Genome Browser Categorie di annotazione: Comparative Genomics

35. Genome Browser • Mouse Net Mouse Net è la traccia che mostra l’insieme degli allineamenti ottimali tra il genoma umano e quello di topo, ottenuti attraverso BLASTZ. BOX = ungapped alignments LINEE = gaps

36. Genome Browser • Mouse Net

37. Genome Browser • Categorie di annotazione: Variation and Repeats • Variation and Repeats • SNPs • Overlap SNPs • Random SNPs • Affy 120K SNPs • Affy 10K SNPs • RepeatMasker • Simple Repeats • Self Chain

38. Genome Browser • SNPs, Simple Nucleotide Polymorphisms • Traccia che mostra • diversi tipi di polimorfismi: SNPs propri, inserzioni e delezioni, duplicazioni • polimorfismi osservati in base alla comparazione di cloni, polimorfismi inclusi nei kit per il Genotyping dell’Affimetrix (10K e 120K).