1. Métabolisme des carbohydrates Chez la levure Exemple du Galactose

2. Mécanisme impliqué dans l’expression coordonnée des gènes Gal Johnston, M. A model fungal gene regulatory mechanism: the GAL genes of Saccharomyces cerevisiae. Microbiol Rev 51, 458-76. (1987).

3. Etude des régulations transcriptionnelles 1980-2000 • - Génétique : identification des facteurs protéiques • Gels retards, Empreintes à la Dnase etc. : identification des séquences de liaison. • Expression d’un gène rapporteur sous le contrôle des séquences promotrices. • Mutagenèse dirigée. •  Modèle : le contrôle de la transcription se réduit à des interactions entre • facteurs de transcription (protéines diffusibles) et • séquences promotrices (ADN). • Facteurs de transcription et corégulateurs (Protéines).

4. La chromatine, substrat de la machinerie transcriptionnelle

5. Le nucléosome : unité élémentaire de la chromatine ADN : 1,67 tours ; 147 paires de bases

6. Structure du nucléosome : • très compacte (forte densité électronique) • - Environ 150 liaisons Hydrogène entre les histones et l’ADN • - Forte distorsion de la double hélice •  Les conditions expérimentales sont très éloignées du contexte physicochimique de la chromatine.

7. Dans le noyau, la fibre chromatinienne s’organise pour former des structures encore plus compactes

8. Régulation de la transcription dans le contexte de la chromatine • Recrutement des facteurs de transcription • Recrutement et mobilité de l’ARN polymérase • Remodelage de la chromatine • - ATP-Dépendant • - ATP-Indépendant

9. Mécanismes de remodelage de la chromatine ATP-Independant Stable Diffusible à l’échelle d’un locus Transmissible (épigénétique) ATP-Dependant Transitoire Local (promoteurs) Non diffusible Non transmissible

10. Mécanismes de remodelage de la chromatine - Remplacement des histones canoniques par des variants d’histones - Chaperons moléculaires - Modifications post-traductionnelles des histones - Enzymes de modification - Déplacement des nucléosomes - Complexes de remodelage (SWI/SNF, ISWI etc.)

11. Enzymes de modification des histones HAT: Histone Acétyl Transférases HDAC: Histones DésACétylases HMT: Histones Méthylases Histone Déméthylase: (LSD1 : Lysine-specific demethylase)

12. Modifications post-traductionnelles des histones Turner, B. M. Cellular memory and the histone code. Cell 111, 285-91. (2002).

13. Modifications post-traductionnelles des histones Turner, B. M. Cellular memory and the histone code. Cell 111, 285-91. (2002).

14. La chromatine est une structure hétérogène: Euchromatine: Gènes actifs Peu condensée (configuration ouverte) ADN peu ou pas méthylé (CpG) Hétérochromatine constitutive: Régions intergéniques, ADN répétitif, centromères Condensée (configuration fermée) ADN méthylé (CpG) Hétérochromatine facultative: Gènes réprimés Condensée (configuration fermée) ADN méthylé (CpG)

15. Les différents états de la chromatine sont caractérisés par des marques épigénétiques spécifiques : « Code Histones » Euchromatine Hétérochromatine

16. Interpréter le « Code Histones » : Les marques épigénétiques permettent le recrutement de protéines effectrices qui modulent la structure de la chromatine. Margueron, R., Trojer, P. & Reinberg, D. The key to development: interpreting the histone code? Curr Opin Genet Dev 15, 163-76. (2005).

17. Etats de la chromatine à l’échelle d’un locus Exemple : Les gènes de l’identité sexuelle Chez la levure

18. Région Mat (mating type) chez Schizosaccharomyces pombe Vengrova, S. & Dalgaard, J. Z. RNase-sensitive DNA modification(s) initiates S. pombe mating-type switching. Genes Dev 18, 794-804 (2004).

19. Analyse moléculaire de la chromatine par immuno-précipitation (ChIP)

21. Les gènes Mat réprimés sont enrichis en HP1, une protéine spécifique de l’hétérochromatine HP1 Noma, K., Allis, C. D. & Grewal, S. I. Transitions in distinct histone H3 methylation patterns at the heterochromatin domain boundaries. Science 293, 1150-5. (2001).

22. Les gènes Mat réprimés sont enrichis en H3K9 méthylée, une modification spécifique de l’hétérochromatine

23. Les gènes Mat réprimés sont appauvris en H3K4 méthylée, une modification spécifique de l’euchromatine

24. Grewal, S. I. & Elgin, S. C. Heterochromatin: new possibilities for the inheritance of structure. Curr Opin Genet Dev 12, 178-87. (2002).

25. Comment ça marche ? 2 4 2 3 1 + Recrutement De Swi6 H3K9-Me (Clr4) ? _ _ H3K4-Me Noma, K., Allis, C. D. & Grewal, S. I. Transitions in distinct histone H3 methylation patterns at the heterochromatin domain boundaries. Science 293, 1150-5. (2001).

26. Rôle de CenH et de HP1/SWI6 Méthylation de H3K9 Indépendante de HP1/SWI6 Méthylation de H3K9 Dépendante de HP1/SWI6 cenH est nécessaire à la méthylation de H3K9 en absence de Swi6 Swi6 est nécessaire à la méthylation de H3K9 en absence de CenH Hall, I. M., Shankaranarayana, G. D., Noma, K., Ayoub, N., Cohen, A., and Grewal, S. I. (2002). “Establishment and maintenance of a heterochromatin domain.” Science, 297(5590), 2232-7.

27. Recrutement De Swi6 H3K9-Me (Clr4) H3K9-Me (Clr4) CenH Hypothèse: Etablissement de l’hétérochromatine à partir de CenH Maintien et propagation dépendante de Swi6

28. Rôle de HP1/SWI6 dans la propagation de l’hétérochromatine

29. CenH, une séquence répétée homologue des séquences centromériques, agit comme un point de nucléation de l’hétérochromatine. HP1/Swi6 est ensuite nécessaire à la propagation de l’hétérochromatine en cis

30. Mécanismes de propagation de l’hétérochromatine

31. Transmission épigénétique Variegation en absence de cenH Ura4-On Ura4-Off Stable

32. Transmission épigénétique des états Ura4-on et Ura4-ff Spores His2+/Ura4-on Spores His2-/Ura4_off Transmission des marques épigénétiques Spécifiques des souches Ura4-On et Ura4-Off

33. Dans les souches Ura4-On, l'hétérochromatine est rétablie en présence d'un excès de Swi6 mais pas de Clr4 Ura4-on Ura4-off Recrutement De Swi6 H3K9-Me (Clr4) H3K9-Me (Clr4) CenH X X X Excès De Swi6 H3K9-Me (Clr4) H3K9-Me (Clr4) CenH X X

34. La machinerie d'ARN-interférence (RNAi) est nécessaire à la répression transcriptionnelle et à l'établissement de l'hétérochromatine Construction Ectopique Ade6 exprimé Ade6 réprimé Ago1 = Argonaute Dcr1 = Dicer Rdp1 = RNA-dep RNA-Pol

35. TSA = Trichostatin Inhibiteur des HDACs La machinerie RNAi n'est pas nécessaire au maintien de la répression transcriptionnelle et de l'hétérochromatine La machinerie RNAi est nécessaire à l'établissement de la répression transcriptionnelle et de l'hétérochromatine

36. Comment stopper l’hétérochromatine ?

37. Passées les bornes, y a plus de limite : Les Eléments Frontières ou Insulateurs

38. Des mécanismes similaires ont été mis en évidence chez la Drosophile…

39. Bigarrure à effet de position (PEV) Grewal02 Répression du gène White : - Associée à une propagation en cis de l’hétérochromatine, visible sur les chromosomes polythènes. - Stochastique (Concentration limitante d’un facteur de propagation ?) - Clonale (transmission à travers les mitoses).

40. Chez la Drosophile aussi, l’établissement de l’hétérochromatine dépend de la machinerie RNAi

41. … Et chez les mammifères

42. Maturation des Thymocytes Thymocytes matures Thymocytes immatures Expression des gènes Rag1, Rag2, Dntt impliqués dans la recombinaison VDJ du récepteur TCRa Répression des gènes Rag1, Rag2, Dntt

43. Modifications post-traductionnelles de la chromatine sur le gène Dntt (ChIP) Su, R. C., Brown, K. E., Saaber, S., Fisher, A. G., Merkenschlager, M., and Smale, S. T. (2004). “Dynamic assembly of silent chromatin during thymocyte maturation.” Nat Genet, 36(5), 502-6. Epub 2004 Apr 18.

44. Propagation de l’hétérochrompatine sur le gène Dntt Euchromatine Hétérochromatine

45. La répression du locus Dntt est corrélée à son association avec l’hétérochromatine péricentromérique

46. Propagation de l’hétérochromatine En trans ?

47. Ikaros Liaison à l’ADN (ZF) Cofacteur transcriptionnel spécifique de la lignée hématopoiétique Activateur ou Répresseur Répresseur des gènes Rag1/2 et Dntt pendant la maturation des thymocytes Existe sous forme de complexe avec NuRD (nucleosome remodelling and deacetylation)

48. Localisation d’Ikaros dans l’hétérochromatine péricentromérique Ikaros g-Satellites Ikaros HP1 Brown, K. E., Guest, S. S., Smale, S. T., Hahm, K., Merkenschlager, M., and Fisher, A. G. (1997). “Association of transcriptionally silent genes with Ikaros complexes at centromeric heterochromatin.” Cell, 91(6), 845-54.

49. Corrélation inverse entre l’expression des gènes et leur localisation à proximité des foyers Ikaros Lymphocytes B Immatures Matures CD19 + + CD8a Ikaros FISH - - l5 - + CD2 - +

50. (NuRD) Su, R. C., Sridharan, R., and Smale, S. T. (2005). “Assembly of silent chromatin during thymocyte development.” Semin Immunol, 17(2), 129-40.