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Atribuição de loci a cromossomos específicos. localização destes loci nos cromossomos. obtenção das sequências nucleotídicas destes loci. Genômica e Proteômica. O que é Genômica ?. Subdivisão da genética de mapeamento, sequenciamento e análise do
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Atribuição de loci a cromossomos específicos localização destes loci nos cromossomos obtenção das sequências nucleotídicas destes loci Genômica e Proteômica O que é Genômica ? • Subdivisão da genética de mapeamento, sequenciamento e análise do funcionamento de genomas inteiros (Thomas Roderick, 1986) • Revista Genômica 1) Estrutural 2) Funcional • Visa a caracterização física do genoma • Caracterização do Transcriptoma (transcritos produzido) • Caracterização do Proteoma (proteínas codificadas) 1) Genômica Estrutural Mapas Cromossômicos: Níveis crescentes de resolução Genômica e Proteômica
Baseado na análise da frequência de recombinantes • Inicialmente utilizava-se marcadores fenotípicos qualitativos Limitações: - precisa realizar cruzamentos controlados - necessidade de obtenção de um grande número de descendentes • É aplicado principalmente a organismos experimentais (Drosophila, Arabidopsis, Neurospora, etc) • Nestes organismos, existem muitos marcadores fenotípicos já mapeados • Entretanto, intervalos entre marcadores ainda era grande • Intervalos não podiam ser mapeados por análise de ligação pois não haviam outros marcadores nestas regiões 1) Genômica Estrutural Mapeamento Meiótico por Recombinação Genômica e Proteômica
1) Genômica Estrutural Mapeamento Meiótico por Recombinação Marcadores Moleculares • Sítio de heterozigose para algum tipo de variação neutra de DNA • Preenchem os intervalos entre os marcadores fenotípicos • RFLPs (Restriction Fragment-Length Polymorphisms) • Minissatélite • Microssatélite • RAPDs (Randonly Amplified Polymorphic DNAs) • AFLPs (Amplified Fragment-Length Polymorphisms) • SSCPs (Single-Strand Conformational Polymorphisms) • DGGEs (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) • SNPs (Single Nucleotide Polymorphysms) Ex. 1: Uso de marcadores Microssatélite Genômica e Proteômica
1) Genômica Estrutural Posicionamento de loci em Mapas Citológicos: Hibridização in situ Marcação com sonda radioativa (cromossomo politênico de Drosophila) Marcação com sonda fluorescente – FISH (Cromossomo humano 11) 1) Genômica Estrutural Mapeamento Físico • É assim chamado pois é obtido pela manipulação direta de fragmentos de DNA, material físico do genoma • Meta: identificar um conjunto de fragmentos clonados superpostos que englobem todo o cromossomo ou o genoma Biblioteca genômica Clones RFLP Grupos superpostos de clones (contigs) Genômica e Proteômica
1) Genômica Estrutural Mapeamento Físico Ordenamento dos clones por clivagem com enzimas de restrição 1) Genômica Estrutural Mapeamento Físico: Ordenamento por FISH Marcação com sonda fluorescente – FISH (Cromossomo humano 11) Marcação com sonda fluorescente - FISH Ordenamento dos clones por FISH Mapa Citológico cromossomo 11 Mapa Citológico cromossomo 11 Genômica e Proteômica
clones em YAC ordenados subclonagem em BACs BACs são novamente ordenados (STS) subclonagem de inserções menores sequenciamento aleatório dos clones 1) Genômica Estrutural Mapa de Ultra-Estrutura: Sequenciamento Estratégias: 1) Sequenciamento aleatório de clones: 2) Sequenciamento de clones ordenados 1) Sequenciamento aleatório de clones: - DNA é fracionado e clonado aleatóriamente - As pontas dos clones são sequenciadas - As regiões sequenciadas são usadas para ordenar os clones 2) Sequenciamento de clones ordenados Genômica e Proteômica
2) Genômica Funcional • Dados de sequências em larga escala são o começo da genômica funcional • Algumas das análises que podem ser feitas: • Caracterização do proteoma por análise de ORFs • Perturbação gênica por nocaute • Silenciamento gênico por Interferência do RNA • Estudo das interações gênicas pelo sistema duplo-híbrido • Análise da expressão gênica através de MicroArranjos de DNA • Uso da proteína fluorescente verde (GFP) para localização in vivo de proteínas a) Caracterização do proteoma por análise de ORF (sequências abertas de leitura) • Softwares de previsão analisam as sequências de DNA - Examinam os 6 possíveis quadros de leitura - Buscam sequências com códons de início e término de tradução - Análise da função da ORF através da busca por sequências homólogas em bancos de dados Ex.: Distribuição provisória dos genes pode ser deduzida Genômica e Proteômica
2) Genômica Funcional b) Perturbação gênica por nocaute • Investiga a função da ORF • Inativação do gene (nocaute) por mutagenese in vitro • procura de qualquer fenótipo mutante • Mais da metade das ORFs inativadas não apresentam efeitos fenotípicos c) Silenciamento gênico por interferência do RNA (RNAi) • Investiga a função da ORF • Duplas fitas de RNA são reconhecidas e clivadas. • Silencia o gene • procura de qualquer fenótipo mutante Genômica e Proteômica
2) Genômica Funcional d) Estudo das interações gênicas pelo sistema duplo-híbrido • Investiga a interação entre proteínas • Proteína GAL4 de leveduras tem 2 domínios: a) ligação ao DNA b) ativação Genômica e Proteômica
2) Genômica Funcional e) Análise da expressão gênica através de MicroArranjos de DNA • Avalia a expressão gênica em organismos, tecidos ou células em diferentes situações fisiológicas ou patológica • Analisa o nível de expressão de milhares de genes simultaneamente • Necessita confirmação posterior por Northern-blotting ou RT-PCR Quantitativo. Genômica e Proteômica
2) Genômica Funcional f) Uso da proteína fluorescente verde (GFP) para localização in vivo de proteínas • Fusão traducional entre o gene de interesse e a proteína GFP • Monitora a sintese e localização de proteínas específicas in vivo Genômica e Proteômica
