Eletroforese Bidimensional como Ferramenta Prote mica

1. Eletroforese Bidimensional como Ferramenta Prote�mica Prof. Carlos Andr� O. Ricart CBSP-Centro Brasileiro de Pesquisa em Prote�nas Departamento de Biologia Celular Universidade de Bras�lia

2. Por muitos anos a gen�mica funcional propagou a no��o de que n�o seria necess�rio estudar n�veis de prote�nas para obter-se dados de �up and down regulation�. Tudo o que era necess�rio seria a determina��o dos n�veis de mRNA

3. Em 1997, Anderson apresentou um trabalho mostrando a primeira compara��o da abund�ncia de mRNA e prote�nas correspondentes. A correla��o foi de 0,43� Anderson &Seihamer (1997) Electrophoresis 18, 533-537 Esses resultados vem sendo confirmados por outros grupos

4. A prote�mica, portanto, parece ser a ferramenta mais apropriada para entender-se o funcionamento dos genes, pois analisa o produto final do genoma

5. A abordagem prote�mica exige a separa��o de prote�nas com alta resolu��o para posterior an�lise

6. Apesar de antiga, at� o momento n�o surgiu uma metodologia capaz de resolver mais prote�nas simultaneamente do que a eletroforese bidimensional

7. Eletroforese Bidimensional (2D-PAGE) 1975 - surge a 2D-PAGE . Trabalhos de O�Farrel; Klose ; MacGillivray et al. Etapas B�sicas: 1- Focaliza��o Isoel�trica (IEF) 2-Eletroforese desnaturante em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE)

8. Por muitos anos a 2D-PAGE sofria do �defeito contemplativo�

9. Um gande passo no uso da 2D-PAGE ocorreu com o progresso nas t�cnicas anal�ticas de identifica��o de prote�nas

10. 2D-PAGE: etapas principais Prepara��o da amostra Focaliza��o Isoel�trica SDS-PAGE Detec��o Digitaliza��o e an�lise de imagem

11. Focaliza��o Isoel�trica (IEF) As mol�culas migram sob a a��o de um campo el�trico em um gel contendo um gradiente de pH. A migra��o se interrompe ao atingirem seu ponto isoel�trico Aplicada a mol�culas que possam ser tanto positivamente ou negativamente carregadas (anfot�ricas)

12. Cadeias laterais das prote�nas possuem grupos ioniz�veis carbox�licos(Asp,Glu), aminos (Lys), imidaz�is (His) e guanidino (Arg) R-COO- + H+ R-COOH R-NH3+ + OH- R-NH2 + H2O

13. A carga l�quida de uma prote�na � fun��o da soma de suas cargas negativas e positivas. A carga � zero no seu ponto isoel�trico (pI) O pI de uma prote�na pode ser alterado por modifica��es qu�micas como fosforila��es O pr�-requisito para uma boa IEF � a forma��o de gradiente de pH est�vel e reprodut�vel

14. Gradientes de pH A focaliza��o isoel�trica � realizada em g�is de poliacrilamida contendo um gradiente de pH que pode ser de dois tipos: Tamp�es anfot�ricos (�free carrier ampholytes�) Gradientes imobilizados de pH (IPG)

15. Tamp�es anfot�ricos (�free carrier ampholytes�) CH2-N-(CH2)X -N-CH2- | | (CH2) X (CH2) X | | NR2 COOH R= H ou -(CH2) X -COOH, X=2 Propriedades:boa condutividade e solubilidade no pI, alta capacidade tamponante, baixa intera��o com a amostra

16. Gradiente de pH com�ampholytes� Com o uso dos �ampholytes� o gradiente de pH � formado sob a��o de um campo el�trico Desvantagens: resultado depende do tempo de focaliza��o, temperatura e efeitos endosm�ticos Westermeier, R. Electrophoresis in Practice, WCH

17. Gradientes imobilizados de pH (IPG) Gradiente formado com derivados de acrilamida contendo grupos tamponantes (�Immobilines�) CH2 = CH-C - N - R || | O H R-grupo carbox�lico ou amino M�todo altamente reprodut�vel pois os grupos tamponantes est�o fixados ao gel Propicia uma alta capacidade de aplica��o de amostra e uma baixa condutividade durante a focaliza��o G�is prontos s�o dispon�veis comercialmente

18. Forma��o de gel de IPG

19. Diagrama de uma rede de poliacrilamida com Immobilines co-polimerizados

20. Reidrata��o de g�is de IPG Westermeier, R. Electrophoresis in Practice, WCH

21. Equipamentos usados no CBSP para Focaliza��o Isoel�trica MultiPhor II (Amersham Biosciences) IPGPhor (Amersham Biosciences)

24. IPG Phor

25. IEF: Aplica��o da amostra Aplica��o direta sobre o gel de IPG, Aplica��o simult�nea � reidrata��o do gel

26. Aplica��o usando �sample cups� A amostra deve ser aplicada em um dos extremos de pH (perto do catodo ou do anodo) onde a maioria das prote�nas est� carregada, minimizando perdas por precipita��o

27. Aplica��o durante a reidrata��o O gel de IPG � reidratado na solu��o contendo a amostra Permite aplica��o de maior quantidade de prote�nas (>10 mg) Minimiza a precipita��o de prote�nas durante a entrada no gel, principalmente para prote�nas de membrana Evita a manipula��o exigida durante a aplica��o usando �sample cups�

28. Equilibrio do gel de IPG 15-30 min em solu��o contendo Tris, Ur�ia, Glicerol, DTT, SDS e bromofenol 15-30 min em solu��o contendo Tris, Ur�ia, Glicerol, iodacetamida, SDS e bromofenol Ap�s equil�brio retirar excesso do tamp�o de equil�brio lavando com tamp�o de corrida SDS-PAGE

29. Segunda dimens�o SDS-PAGE Sistema horizontal. Ex.Mutiphor II Electrophoresis unit (Pharmacia Biotech) Sistema vertical. Ex. SE 600, IsoDalt (Amersham), Investigator (Millipore), Protean II xi (BIO-RAD), etc.

31. Tamanho do poro T- concentra��o total de acrilamida T= (a+b) x 100 V C - porcentagem de �crosslinker� C = b x 100 a + b

32. SDS-PAGE-sistema vertical Vantagens: Possibilidade de uso de equipamento pre-existente no laborat�rio, permite corridas simult�neas de v�rios g�is dependendo do sistema utilizado

34. SDS-PAGE-Sistema horizontal Vantagens:Melhor resolu��o segundo a. Gorg, possibilidade de uso de g�is �pre-casted� Desvantagens: permite apenas duas corridas simult�neas

36. Composi��o dos tamp�es de amostra Tamp�es de amostra normalmente possuem: Ur�ia Detergente Agente redutor Anf�litos Inibidores de proteases

37. Prepara��o da Amostra Para a focaliza��o isoel�trica, as prote�nas devem ser completamente solubilizadas, desagregadas, desnaturadas e reduzidas

38. O processo de solubiliza��o deve, portanto, atingir os seguintes objetivos: Quebrar intera��es macromoleculares incluindo todas as intera��es n�o covalentes e as pontes dissulfeto Prevenir modifica��es nas prote�nas Manter as prote�nas em solu��o durante a 2D-PAGE

39. Agentes Redutores 2-mercaptoetanol era usado nos prim�rdios. Sua a��o tamponante destr�i o gradiente de pH na regi�o b�sica. DTT � o mais utilizado. Obs: prote�nas com muita ciste�na n�o s�o totalmente reduzidas com DTT. Tributilfosfina (TBP) � o mais potente agente redutor dispon�vel. Obs: � vol�til, t�xico e requer solvente org�nico para dissolver em �gua. Tris(carbixietil) fosfine (Pierce Co.) � uma fosfina hidrossol�vel.

40. Rompimento de intera��es n�o covalentes 1- Agentes caotr�picos: Uso de reagentes caotr�picos, como a ur�ia, por alterarem os par�metros do solvente exercem profundos efeitos sobre todos os tipos de intera��es n�o covalentes. A tiour�ia � um agente caotr�pico mais eficiente que a ur�ia, mas pouco sol�vel em �gua. A mistura ur�ia- tiour�ia � bastante eficiente.

42. Cuidado com a carbamila��o causada pela ur�ia! - A ur�ia em �gua existe em equil�brio com cianato de am�nio (cujos n�veis aumentam com a temperatura. - Cianato pode reagir com aminas (N-terminal ou lisinas). - Consequ�ncia: heterogeneidade artefactual de carga, bloqueio N-terminal, etc. - Como evitar: grau de pureza da ur�ia, evitar temperaturas acima de 37�C, desionizar solu��es de ur�ia e usar �scavengers� de cianato (amina prim�ria).

43. Rompimento de intera��es n�o covalentes 2- Detergentes: Rompem intera��es hidrof�bicas Para a focaliza��o isoel�trica, n�o podem ter carga l�quida.Devem ser n�o-i�nicos ou zwitterionicos SDS deve ser evitado!! Os mais compat�veis com as necessidades s�o o Triton X-100 e o CHAPS

44. Mantendo as prote�nas intactas Hidrolases (fosfatases, glicosidases e proteases) Proteases s�o resistentes � ur�ia e a detergentes Inibidores de proteases nem sempre s�o suficientes Solubiliza��o em SDS quente Homogeiniza��o da amostra em TCA dilu�do ou TCA-acetona

46. Remo��o de sais Os sais interferem diretamente no processo eletrofor�tico. Eles migram atrav�s do gradiente de pH produzindo calor e acumulam-se nas duas extremidades. Isso causa zonas de alta condutividade, queda de voltagem e diminui��o do campo el�trico. Nessa zonas, as prote�nas n�o focalizam e aparecem como faixas. As tiras de IPG incham nessas zonas de aalta condutividade devido ao ac�mulo de �gua.Remo��o por precipita��o ou di�lise.

47. Detec��o Fatores importantes: Faixa din�mica de detec��o Linearidade Reprodutibilidade entre experimentos Variabilidade inter prote�na Compatibilidade com m�todos de identifica��o

48. Principais m�todos Coomassie Blue Nitrato de Prata Reagentes fluorescentes Marca��o radioativa

49. Apesar da enorme quantidade de trabalho prote�mico, continuamos observando a ponta do iceberg. A grande maioria das prote�nas prote�nas raras (e preciosas) ainda est�o escondidas. Todos est�o identificando as mesmas prote�nas (as mais abundantes)

50. Por que?

51. A abund�ncia das prote�nas varia muito Ex: Nas c�lulas Humanas Actina (108 c�pias /c�lula) Receptores celulares e fatores de transcri��o (102-103 c�pias /c�lula) Dinamic range 105-106 !!!! Dinamic range 2D-PAGE = ~104

52. Obs: a situa��o � ainda pior em certas amostras como o soro sangu�neo onde albumina � presente em concentra��es de 40 mg/mL e citocinas em pg/mL . Faixa din�mica de 109

55. Como resolver este problema?

56. Uma op��o � o pr� fracionamento da amostra

57. Tipos de fracionamento Celular Cromatogr�fico Eletrofor�tico

58. Outra op��o � o uso de gradientes estreitos de pH (�narrow pH gradients�)

61. Limita��es da abordagem 2D-PAGE/MS Dificuldade de automa��o Incapaz de detectar, identificar e quantificar todas as prote�nas de amostras complexas simultaneamente Dificuldade de resolver prote�nas extremamente �cidas ou b�sicas, assim como as muito hidrof�bicas.

62. �2D or not 2D?� Se o objetivo � prover uma lista de todas as prote�nas presentes em uma amostra, metodologias baseadas em cromatografia multidimensional acoplada � espectrometria de massa em sequ�ncia (MS/MS) pode fornecer resultados superiores Se o objetivo for observar mudan�as quantitativas na express�o de prote�nas ou suas modifica��es p�s traducionais durante um processo biol�gico, os g�is bidimensionais ainda s�o inigual�veis.