Evidência de Recombinação em Alpha-Papilomavírus Humano

1. Evidência de Recombinação em Alpha-Papilomavírus Humano Abordagens Computacionais Guilherme Carvalho Leal

2. O Papilomavírus • Vírus de DNA dupla-fita circular • Infecta mamíferos e aves (HPV, BPV..) • Célula hospedeira: melanócito • Tem variedades carcinogênicas que causam carcinoma no trato genital [HPV: 0,5M casos/ano; 274k mortes/ano]

3. O Papilomavírus

4. O Papilomavírus • 100+ tipos de HPV conhecidos hoje • Possibilidade de recombinação? • Viabilidade de linhagens ”engineered“ • Surgimento de variações do HPV16 • Grande pluralidade de tipos de HPV • Freqüente co-infecção por 2+ tipos

5. Recombinação • Dois alelos (um de cada gene) que estão associados em duas regiões de uma mesma seqüência de DNA tornam-se dissociados • Um dos dois alelos é substituído por algum outro alelo encontrados no mesmo locus em uma segunda molécula de DNA.

6. Recombinação • Força-chave que dirige a evolução dos genomas • Combinações de alelos são associadas a doenças genéticas e a resistências a drogas em patógenos • Logo, não deve ser negligenciada

7. Recombinação • 2 tipos clássicos

8. Recombinação em HPV • Angulo, Carvajal-Rodríguez (2007) • Estimativas de recombinação de diferentes genes (E6, E7, L1 e L2) em diferentes grupos • GI: 14 tipos de alto risco mais comuns, n=14seqs • GII: 6 tipos de baixo risco, n=8seqs • GIII: 3 tipos de baixo risco e 5 de risco desconhecido, n=12seqs • HPV16: n=8seqs [clustering por critérios filogenéticos, epidemiológicos e clínicos]

9. Recombinação em HPV • Mas como estimar a taxa de recombinação? • Phylogenetics-based methods • Substitution-based methods • Model-based methods

10. Evolução dos Estimadores • Coalescent likelihood estimators • 1996-2001: full-likelihood methods usavam toda a informação contida nos dados (IMPRATICÁVEL!)

11. Evolução dos Estimadores • 2001 em diante: pseudolikelihood methods.“aproximar a full-likelihood, em vez de computá-la” • Hudson (2001): composite-likelihood estimator(CLE). Analisa os sítios divergentes par a par • McVean, Awadalla & Fearnhead (2002) Extensão do CLE de Hudson. LDhat (package) > pairwise (program)

12. Evolução dos Estimadores • McVean, Awadalla & Fearnhead (2002) Assumem um modelo com: - 2 alelos por locus - mutação reversível e simétrica - taxa de mutação por geração:homogênea nos sítios Ou seja: - somente sítios c/ exatos 2 alelos são considerados - a identidade desses alelos (A, C, G ou T) é perdida Testes com diversos modelos de evolução revelaram que esse método é robusto somente para pequenos “misspecifications” do modelo de mutação.

13. LDhat • Ldhat (McVean, 2002): pacote de programas escrito em C para a análise de recombinação em dados de genética populacional • Programa-chave: pairwise

14. pairwise • Entrada • conjunto de alelos divergentes alinhados • a localização de cada alelo divergente • a taxa de mutação da população, θ =4Nμ (N=tamanho efetivo da população; μ=taxa de mutação por sítio por geração)

15. pairwise • Processamento • Estima a “coalescence likelihood” em cada par divergente, tratando-os separadamente. • Pares divergentes são agrupados por equivalência, reduzindo a qtd de dados • Likelihood Permutation Test (LPT)

16. pairwise - Estima a taxa de recombinação ρ ρ = 4Ner (diploid species) ou ρ = 2Ner (haploid species) Ne = effective population size r = genetic map distance r = dS d= physical distance S= per site rate of recombination

17. pairwise **Sites file** 4 10 2 >GenotypeA 122110?000 >GenotypeB 1111201100 >GenotypeC 011111?112 >GenotypeD 2112210100 data is haplotype(1) or genotype(2) number of sequences/genotypes number of sites in the alignment **locs file** 10 1200 L 1 57 180 187 223 250 438 509 878 1034 number of SNPs (segregating sites) total length of the region analysed model of crossing-over(L) or gene conversion(C) is fitted

18. Evolução dos Estimadores • Entretanto... • O método de McVean (2002) é limitado quanto à realidade biológica. • Exemplo: HIV1 • Modelo de substituição GTR (General Time Reversible) • Variação entre as taxas de mutação dos diferentes sítios • População muito instável • Sofre importantes pressões seletivas

19. Evolução dos Estimadores • Carvajal-Rodríguez, Crandall & Posada (2006) • Testaram o pairwise sob modelos mais complexos e realísticos • Liberaram algumas das restrições a fim de aumentar a robustez do estimador. kpairwise

20. kpairwise • As mudanças no kpairwise • Leva em conta todos os sítios; não só aqueles com 2 alelos • A taxa de mutação pode ser variável entre sítios • Modelo de substituição com 6 taxas para as mudanças entre os 4 nucleotídeos (A, C, G e T) em vez de uma única taxa entre dois estados inespecíficos (1 e 0) • Modelos populacionais que levam em conta diferentes padrões de crescimento, seleção e subdivisão

21. kpairwise • Consideravelmente mais lento que o pairwise • O número de combinações alélicas diferentes é bem maior → enumeração e tabelamento menos eficientes • Mesmo assim, um sistema de tabelamento guarda os likelihoods para um dado θ,os parâmetros da substituição de nucleotídeos, o número de seqüências e uma grade de valores ρ. Cada vez que o algoritmo é rodado, procura-se os dados de que se precisa nas tabelas; se não encontrados, eles são calculados e então armazenados.

22. kpairwise • Ainda passível de significativas subestimações da taxa de recombinação no caso de: • Crescimento exponencial • Seleção direcional • Estruturas populacionais • Amostragem não-contemporânea • Logo, novos estimadores de recombinação, mais sofisticados, são necessários. HIV1

23. Recombinação em HPV • Resultados • Gene com taxa de recombinação mais alta: E6 • Gene com sinal de recombinação no maior número de grupos: L2

24. Recombinação em HPV • Discussão • A evidência de recombinação em HPV é importante porque pode sugerir equívocos em filogenias baseadas nos genes em questão • Novos tipos recombinantes podem estar sendo gerados constantemente

25. Links • McVean’s LDhat • http://www.stats.ox.ac.uk/~mcvean/LDhat/ • Carvajal-Rodríguez’s kpairwise • http://darwin.uvigo.es/software/kpairwise.html