ELISA

1. ELISA HIV infekcijas pierādīšanas eksperiments. HIV antivielu pierādīšana asinīs

2. Skolotāja sagatavošanās eksperimentam

3. 1. Buferšķīdumu sagatavošana • Mazgājošais buferšķīdums (900 ml) 805 ml H2Odest.+ 90 ml PBS (10x) + 4,5 ml Tween 20 Mazgājošais buferšķīdums nepieciešams antivielu šķīduma atšķaidīšanai un mikrotitrēšanas stobriņu mazgāšanai. • Tween 20 satur BSA buferšķīdumu ,kurš bloķēs brīvās proteīna virsmas molekulas. • PBS-buferšķīdums (100 ml) • 90 ml H2Odest. + 10 ml PBS buferšķīdums (10x) • PBS-bufferšķīdums nepieciešams hidrofīlo antigēnu un antivielu rehidratācijai.

4. 2. Rehidratācija ! • Atskrūvējiet korķi antivielu un antigēnu šķīdumu traukiem! • Iepiliniet pa 0,5 ml atšķaidīto PSBbufer šķ. antigēnu un primāro un sekundāro antivielu traukos! • Aizskrūvējiet traukus ar korķiem un kratiet ap 2 min.! Visi darba šķīdumu krājumi ir 50 x koncentrētāki!

5. 3. Etiķetes uzlīmēšana • Marķējiet ar etiķetēm polifenola pudeles: • Antigēns • Primārā antiviela • Sekundārā antiviela Antigēns

6. Skolēnu sagatavošanās eksperimentam 8 darba grupām Reaģentu daudzums ir pietiekošs 8 darba grupām 3 eksperimentiem! (3 x 160 µl kopējais reaģentu patēriņš = 480 µl; 500 µl -pudeles tilpums )

7. Stobriņa krāsa Apzīmējums Stobriņu saturs Tilpums zaļš AG antigēns 800 µl oranžs sAB Sekundārā antiviela 800 µl brūns SUB substāts 800 µl violēts pAV Primārā antiviela 120 µl zils M B Mazgājošais buferšķīdums 120 µl dzeltens - - - - Tukšs ! Lietoto stobriņu pārskats:

8. 1. Paraugu sagatavošana P1 – P8 • Uzrakstiet uz 8 dzeltenajiem stobriņiem savas darba • grupas Nr.! • Piepiliniet 60 µl primārā antivielu šķ. (p AV, pozitīvā • testa rezultātu) vai • 60 µl mazgājošā buferšķīduma ( MB, negatīvā testa • rezultātu) katrā no dzeltenajiem stobriņiem ar Nr. no • P1 līdz P8! Numurējiet tos! • Izsniedziet pa vienam stobriņam katrai darba grupai! !

9. Stobriņa saturs Krāsa Apzīmējums Tilpums zaļš AG antigēns 800 µl oranžs sAB Sekundārās antivielas 800 µl brūns SUB substrāts 800 µl violets pAB Primārās antivielas 120 µl zils M B Buferšķīdums mazgāšanai 120 µl dzeltens P1-P8 Asins serumu paraugi ” no 1-8 60 µl katrā Sagatavoto stobriņu pārskats:

10. 2. ELISA testa veikšana

11. 2.1 Antigēnu saistīšana uz mikrotitrēšanas stobriņiem - Apzīmējiet stobriņus pēc sekojoša parauga! + + - - P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 • Iepiliniet 50 µl antigēnu šķ. (AG, zaļais stobriņš) – katrā no 12 stobriņiem! • Inkubējiet tos 5 min.!

12. Antivielu pierādīšanapamatlikums • Antigēns piesaistās pie virsmas

13. 2. Mikrotitrēšanas stobriņu mazgāšana • Izkratiet stobriņu saturu uz salvetēm! • Iepiliniet 250 µl mazgājošā bufera katrā no stobriņiem! Uzmanību!Pilinot buferšķīdumu trauciņu mazgāšanai, tas nedrīkst ielīt citos stobriņos! • Vēlreiz izkratiet stobriņu saturu uz salvetēm!

14. Antivielu pierādīšanapamatlikums • Antigēni piesaistās pie virsmas • Visa virsma ir “ aizņemta” ar piesaistītajām antivielām

15. + + - - P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 2.3. Paraugu sagatavošana kontrolei pAb • Pozitīvai kontrolei: piepiliniet 50 µl primāro antivielu • ( pAV, violetajā stobriņā) divos ar“ + ”apzīmētajos stobriņos! • Negatīvai kontrolei:piepiliniet 50 µl mazgājošo buferšķ. ( MB,zilajā stobriņā) divos ar “ - ” lapzīmētajos stobriņos! WB

16. + + - - P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 2.3. Paraugu sagatavošana kontrolei • Paraugos 1-8:piepiliniet 50 µl testējamo personu serumus P1- P8 katrā no atbilstošajiem 8 stobriņiem! • Lietojiet jaunus uzgaļus katram stobriņam! • Inkubējiet tos 5 min.!

17. Antivielu pierādīšanapamatlikums • antigēns piesaistās pie virsmas • visa virsma ir “aizņemta” ar piesaistītajām antivielām • pievienojot serumu, var pierādīt antivielu klātbūtni

18. 2.4. Mikrotitrēšanas stobriņu mazgāšana(skatīt 2.2.) tukšs + 250 µl M B tukšs

19. 2.5. Sekundāro antivielu pievienošana • Piepiliniet 50 µl sekundāro antivielu šķ. (sAB, oranžais stobriņš) katrā no12 stobriņiem! • Inkubējiet tos 5 min.!

20. Antivielu pierādīšanapamatlikums • antigēns piesaistās pie virsmas • visa virsma ir “aizņemta” ar piesaistītajām antivielām • pievienojot serumu, var pierādīt antivielu klātbūtni • enzīma piesaistītās antivielas piesaistās pie antivielu epitopa

21. 2.6. Mikrotitrēšanas stobriņu divkārša mazgāšana (skatīt 2.2. ) tukšs + 250 µl MB tukšs

22. 2.7. Substrāta pievienošana • Piepiliniet 50 µlsubstrāta šķ.(SUB, brūnais stobriņš)katrā no 12 stobriņiem! • Inkubējiet tos 5 min.!

23. Antivielu pierādīšanapamatlikums • antigēns piesaistās pie virsmas • visa virsma ir “aizņemta” ar piesaistītajām antivielām • pievienojot serumu, var pierādīt • antivielu klātbūtni • enzīma piesaistītās antivielas piesaistās pie antivielu epitopa • reakcija tiek pierādīta ar enzīmu iesaistīšanos reakcijās

24. + + - - P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 3. Izvērtējums Tests ir + , ja stobriņu saturs kļūst zils. Tests ir - , ja to saturs paliek bezkrāsains ( kā kontrole). Salīdziniet savas darba grupas rezultātus ar citām!