1 / 33

Metode molekularn e geneti ke u direktnoj ili indirektnoj detekciji monogenskih bolesti

Metode molekularn e geneti ke u direktnoj ili indirektnoj detekciji monogenskih bolesti. Podela tehnika. Analiti čke tehnike. Preparativne tehnike. Hibridizacija DNK. Izolovanje DNK. Sekvenciranje DNK. Centrifugiranje. Elektroforeza. Enzimska digestija DNK. Rekombinovanje DNK.

jaime-merrill
Télécharger la présentation

Metode molekularn e geneti ke u direktnoj ili indirektnoj detekciji monogenskih bolesti

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. Metode molekularnegenetike u direktnoj ili indirektnoj detekciji monogenskih bolesti

  2. Podela tehnika Analitičke tehnike Preparativne tehnike Hibridizacija DNK Izolovanje DNK Sekvenciranje DNK Centrifugiranje Elektroforeza Enzimska digestija DNK Rekombinovanje DNK Kloniranje DNK Umnožavanje DNK

  3. Preparativne tehnike: Izolovanje DNK • Maceriranje tkiva – mehaničko • Razaranje ćelija • Mehanička liza (sonikacija, smrzavanje, mlevenje) • deterdženti- SDS, • Enzimi - lizozim, proteinaze • Helirajući agensi – EDTA • Redukujući agensi - DTT

  4. Izvori biološkog materijala • Krv • Semena tečnost • Pljuvačka • Urin • Dlaka • Zub • Kost • Bilo koje tkivo

  5. Purifikacija DNK • Rastvaranje organskim rastvaračima (fenol:hloroform:izoamilalkohol 25:24:1) i taloženje u etanolu • Precipitacija DNK cetiltrimetilamonijum bromidom-CTAB, resuspenzija solima, digestija RNazom, taloženje etanolom. • Precipitacija DNK na silikatne čestice u haotropnim solima (guanidintiocijanat-GTC) u dva formata (u rastvoru i u koloni) • Izolacija helirajućim smolama • Izolacija pomoću paramagnetnih čestica

  6. U zavisnosti od veličine fragmenata U zavisnosti od potrebne rezolucije Agarozna i poliakrilamidna (i drugi polimeri) Nativna i denaturišuća Razdvajanje po veličini i naelektrisanju Elektroforeza u gelu

  7. DNK je negativno naelektrisana (putuje ka anodi) Veći fragmenti putuju sporije Molekularno “sito” Elektroforeza u gelu

  8. Max apsorpcije 260 nm- providna DNK-vezujuće boje (Etidijum bromid, Cyber Green...) Vizualizacija DNK molekula

  9. Kapilarna elektroforeza Fluorescentno obeleženi fragmenti DNK Vizualizacija DNK molekula

  10. A T Single nucleotide polymorphisms C G Tačkasti polimorfizmi: SNPs adenine G C T T C G thymin guanine C G A C G A G C T T C G cytosine C G A C G A

  11. Sekvenciranje DNK • Maxam Gillbertova hemijska metoda degradacije • Sangerova enzimska metoda terminacije sinteze lanaca

  12. Šta je potrebno za Sangerovu metodu • Više kopija molekula koji se sekvencira (klonirani fragment ili PCR produkt) • Odgovarajući prajmer • DNK polimeraza (Sekvenaza) • dNTPs, ddNTPs • Sistem za razdvajanje DNK fragmenata • Sistem za detekciju DNK fragmenata

  13. Sekvenciranje molekula DNK Sangerovom metodom

  14. DNK sekvenciranje

  15. Tokom elektroforeze se fragmenti razdvajaju po veličini

  16. Pristupi za sekvenciranje • Manuelno • Radioaktivnoobeležen prajmer ili dNTPs • Veća vernost • Vrlo sporo • Zahteva puno rada • Automatsko • Fluorescentno obeležen ddNTP • Vrlo brzo • Walk-away procedure

  17. Manuelno sekvenciranje • Nalivanje denaturišućeg (urea) poliakrilamidnog gela (1 dan) • Elektroforeza (min 6 sati) • Ekspozicija 1 dan (phosphoimager skraćuje) • Čitanje 300-350 baza (par sati) • Niža cena

  18. Tipičan izgled autoradiograma

  19. Automatsko sekvenciranje • Formati: • Sva 4 nukleotida u isti uzorak • 1000 baza po uzorku • 1 do 96 kapilara po mašini • Optimizovani polimeri (reusable) • Detekcija fluorescentno obeleženih nukleotida

  20. Automatski sekvenatori

  21. Sa grafika fluorescentnih pikova može se pročitati sekvenca molekula DNK u 5’ to 3’ Intenzitet fluorescencije (4 različite boje) Vreme

  22. Automatski sekvenatori sa kapilarom ABI 310 1 kapilara 10 uzorka 10 kBaza dnevno ABI 3100 16 kapilara 768 uzoraka 845 kbaza dnevno ABI 3730xl 96 kapilara 4600 uzoraka 5 mega baza dnevno E.Coli 4Mbp

  23. RT-PCR (qPCR)

  24. RT-PCR (qPCR) nastavak

  25. Drugi DNKpolimorfizmi : STRs 2-7 nuc=STR 10-100 nuc=VNTR Uzastopno ponovljeni nizovi OGROMNA VARIJABILNOST!!!!

  26. AATG Kratki uzastopni ponovci (STRs) 7 ponovaka 8 ponovaka Region sa ponovcima je varijabilan a uokvirujući segmenti su konstantni Homozigot = Oba alela su iste dužine Heterozigot = Aleli se razlikuju po dužini

  27. Simultano umnožavanje većeg broja gena (kraće vreme) Osetljivost velika (manje od 1 ng)(manje uzorka) Mogućnost analize mešanih i degradovanih uzoraka Različite fluorescentne boje za razlikovanje STR alela koji se preklapaju po veličini Multiplex PCR

  28. Multiplex PCR

  29. Izgled amplifikovanih fragmenata

  30. PP16 Promega TPOX D3S1358 TH01 D8S1179 D5S818 vWA D7S820 CSF1PO Amel D13S317 Amel D16S539 D18S51 Penta E D21S11 Penta D FGA

More Related