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Proteome & Proteomics

Proteome & Proteomics. Proteome & Proteomics 定义. Proteome ： 1994 年，由澳大利亚 Macguarie 大学的 Wilkins 等首先提出： “ 蛋白质组指的是一个基因组所表达的全部蛋白质 ” (proteome indicates the proteins expressed by a genome) “ proteome ” 是由蛋白质一词的前几个字母 “ prote ” 和基因组一词的后几个字母 “ ome ” 拼接而成 蛋白质组 (Proteome) : 细胞内的全部蛋白质. Proteomics 定义.

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Proteome & Proteomics

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Presentation Transcript

  1. Proteome & Proteomics

  2. Proteome & Proteomics 定义 • Proteome： • 1994年，由澳大利亚Macguarie大学的Wilkins等首先提出：“蛋白质组指的是一个基因组所表达的全部蛋白质”(proteome indicates the proteins expressed by a genome) • “proteome”是由蛋白质一词的前几个字母“prote”和基因组一词的后几个字母“ome”拼接而成 • 蛋白质组(Proteome) :细胞内的全部蛋白质

  3. Proteomics定义 • 蛋白质组学是以蛋白质组为研究对象，研究细胞内所有蛋白质及其动态变化规律的科学 • 最早是在1995年提出的，它在本质上指的是在大规模水平上研究蛋白质特征： • 表达水平 （量） • 翻译后的修饰（成熟与调控） • 蛋白与蛋白相互作用（信号通路）等 • 由此获得蛋白质水平上的关于疾病发生，细胞代谢等过程的整体而全面的认识

  4. Proteome 与 Genome关系 • 互补的角度/空间来研究细胞的分子架构 • 相辅相成 • Genome --- 导演 RNome --- 编剧 Proteome---演员

  5. Proteome 与 Genome区别 • 稳定性 • Proteome --- 静态 • Genome --- 动态 • 修饰化程度 • Proteome --- 高 • Genome --- 底 • 复杂程度 • Proteome --- 高 （20aa + 高度多样性修饰） • Genome --- 底 （4nt） • 特异性 • Proteome --- 组织和细胞特异性 • Genome --- 无组织和细胞特异性

  6. 功能蛋白质组(functional proteome) • 1997年，由Cordwell和Humphery-Smith提出的，它指的是在特定时间、特定环境和实验条件下基因组活跃表达的蛋白质。 • 功能蛋白质组只是总蛋白质组的一部分，通过对功能蛋白质组的研究，既能阐明某一群体蛋白质的功能，亦能丰富总蛋白质数据库，是从生物大分子(蛋白质、基因)水平到细胞水平研究的重要桥梁环节。

  7. 功能蛋白质组

  8. 蛋白质组学研究思路与方法 策略、技术、工具

  9. 蛋白质组研究相关网站 • 蛋白质组学研究依赖生物信息学和网络技术 • http://www.proteomeworks.bio-rad.com蛋白质组研究技术、信息等 • http://www.proteinpathways.com发现新蛋白及新作用(新药开发) • http://www.proteome.med.umich.edu蛋白质组研究相关企业、各 种仪器来源、新闻等 • http://www.proteome.co.uk各种蛋白质组研究相关信息 • http://www.micromass.co.uk介绍蛋白质鉴定的先进仪器 • http://www.expasy.ch蛋白质鉴定专家系统，Swiss Institute of Bioinformatics • http://expasy.proteome.org.au蛋白质鉴定专家系统，Australian Proteome Analysis Facility • http://expasy.cbr.nrc.ca蛋白质鉴定专家系统，Canadian Bioinformatics Resours

  10. 主要专业术语及其英文对照和缩写 • IPG-IEF：固相pH梯度等电聚焦（immobilized pH gradients isoelectric focusing） • SDS- PAGE：十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（Sodium dodecyl sulfate- polyacrylamide gel electrophoresis） • 2-DE：双向电泳(Two Dimensional Electrophoresis) • HPLC：高效液相色谱（High performance Liquid Chromatography） • MALDI-TOF MS：基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry)

  11. 研究策略与技术 • 两条互补的实验流程 • 基于凝胶的工作流程 （Gel-based workflow） • 基于液相色谱的工作流程 （LC-based workflow）

  12. 蛋白质组学实验室所需的条件

  13. 双向凝胶电泳（2DE） • 是等电聚焦电泳和SDS-PAGE的组合 • 即先进行等电聚焦电泳（按照pI分离） • 然后再进行SDS-PAGE（按照分子大小） • 凝胶经染色得到二维分布的蛋白质图

  14. 蛋白质组研究的基本技术 • 2D-SDS-PAGE： • 样品制备 • 第一向IPG-IEF电泳 • IPG平衡 • 第二向SDS-PAGE电泳 • 染色（银染）及 图谱分析 • 目标蛋白获取及其鉴定（MC分析）

  15. 2DE结果图谱

  16. 蛋白质组研究的基本技术--- 样品预分离 • 样品的制备（预处理）： • 组织 • 细胞 • 细胞器（线粒体、叶绿体、细胞核）

  17. 蛋白质组研究的基本技术--- 蛋白提取 • 重要性： • 在制备时丢失的蛋白永远不能在后面实验中弥补 • 把蛋白质看作具有独特而奇妙性质的实体 • 原则： • 使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态 • 防止样品在聚焦时发生蛋白的聚集和沉淀 • 防止在样品制备过程中发生样品的抽提后化学修饰（如酶性或化学性降解等） • 完全去除样品中的核酸和某些干扰蛋白

  18. 蛋白质组研究的基本技术--- 蛋白提取 • 步骤： • 破碎 • 沉淀蛋白 • 去除杂质

  19. 蛋白质组研究的基本技术--- 蛋白提取 • 样品制备流程 --- 破碎 尽可能减少蛋白水解/其它形式蛋白降解原则 • 机械法（超声波法、高压法 、机械匀浆法 ） • 化学法（去污剂法、酶裂解法 ） • 物理法（液氮研磨法、循环冻融法、渗透 法 、玻璃珠破碎法 ）

  20. 蛋白质组研究的基本技术--- 蛋白提取 • 样品制备流程 --- 沉淀蛋白 去杂浓缩后蛋白可溶性是关键 • TCA-丙酮沉淀法 • 三氯醋酸（TCA）沉淀法 –引起降解/修饰 • 丙酮沉淀法 • 硫酸铵沉淀法 –影响IEF • 醋酸铵沉淀法 –步骤繁琐

  21. 2D电泳结果影响因素分析

  22. 蛋白质组研究的基本技术--- 蛋白提取 • 样品制备流程 ---- 去除杂质 关键是尽量不丢失蛋白和减少蛋白修饰 • 核酸的清除 （DNase/Rnase） • 多糖的清除 （超离心 、TCA沉淀等） • 去污剂的清除 （丙酮沉淀法等） • 盐离子和外源带电小分子的清除（透析、TCA-丙酮沉淀法）

  23. 2D电泳结果影响因素分析 可能原因：TCA残留致使Pr丢失 可能原因：样品含高丰度Pr

  24. 2D电泳结果影响因素分析 可能原因：Urea 不纯 可能原因：Tris质量不好

  25. 蛋白质组研究的基本技术--- 蛋白提取 • 样品制备注意事项： • 蛋白质水解 ---- 蛋白酶抑制剂(PMSF等) • 特殊样品的制备 (低丰度 、强碱性蛋白质 （核糖体）、极端分子量 ) • 样品定量 • 重复性

  26. 2D-SDS-PAGE重复性 The same protocol and sample, however not the same results Rec: similar; cir: different

  27. 2-DE • 第一向IPG-IEF电泳 • IEF是一种根据样品的等电点不同而使它们在pH梯度中相互分离的一种电泳技术 • 将等电点不同的蛋白质混合物加入有pH梯度的凝胶介质中，在电场内经过一定时间后，各组分将分别聚焦在各自等电点相应的pH位置上，形成分离的蛋白质区带 • 从而得知其等电点信息

  28. IEF的基本条件 voltage Time Volt-Hours Ramp step 1 250 20min －－－ Linear step 2 4000 7 cm 2hr Linear －－－ step 3 4000 －－－ 10,000V-hr Rapid total 5 hr 14,000V-hr step 1 250 20min －－－ Linear 11 cm step 2 8000 2.5hr －－－ Linear step 3 8000 －－－ 20,000V-hr Rapid 5.3 hr total ～30,000V-hr step 1 250 20min －－－ Linear 17 cm step 2 10000 2.5hr －－－ Linear step 3 10000 －－－ 40,000V-hr Rapid total 7 hr ～50,000V-hr

  29. IPG-IEF电泳

  30. 2-DE • 第二向垂直SDS-PAGE电泳 • 聚丙烯酰胺凝胶形成网状结构，具有浓缩效应、电荷效应、分子筛效应 。SDS与蛋白质形成雪茄状带负电荷复合物，从而消除了蛋白间的电荷及形状差异，电泳速度仅与分子量有关 • 从而得知其分子量信息

  31. 第二向垂直SDS-PAGE电泳 • 凝胶浓度与其对应的分离范围 胶浓度 分离范围(KD) 5% 36-200 7.5% 24-200 10% 14-200 12.5% 14-100 15% 14-60

  32. Ettan Dalt twelve电泳系统 第二向垂直SDS-PAGE电泳 • 步骤： • 溶液配置(Buffer、Bis-Acr、AP、TEMED) • 灌胶 • 电泳

  33. 第二向垂直SDS-PAGE电泳 Ettan Dalt six电泳系统

  34. 2-DE凝胶蛋白质斑点的检测 • 染色： 1）考马斯亮兰染色法； 2）银染法； 3）负染法； 4）荧光染色法； 5）放射性同位素标记法等

  35. 2-DE凝胶蛋白质斑点的检测 • 图像扫描和分析——Image Scanner II

  36. 2-DE凝胶蛋白质斑点的检测 • 全自动斑点切取系统（Ettan Spot Picker）

  37. 2-DE凝胶蛋白质斑点的检测 • 质谱或MALDI-TOF MS • 质谱分析基本原理是使试样中各组分电离生成不同荷质比的离子，经加速电场的作用，形成离子束，进入质量分析器，利用电场和磁场使发生相反的速度色散——离子束中速度较慢的离子通过电场后偏转大，速度快的偏转小；在磁场中离子发生角速度矢量相反的偏转，即速度慢的离子依然偏转大，速度快的偏转小；当两个场的偏转作用彼此补偿时，它们的轨道便相交于一点。与此同时，在磁场中还能发生质量的分离，这样就使具有同一质荷比而速度不同的离子聚焦在同一点上，不同质荷比的离子聚焦在不同的点上，将它们分别聚焦而得到质谱图，从而确定其质量。

  38. 2-DE凝胶蛋白质斑点的检测 • MALDI-TOF MS • 样品溶于固定的底物中形成晶体，用激光脉冲使其离子化，离子被加速后通过飞行管时分离，所有离子均可被检测，常用来测蛋白质、多肽、核酸和多糖等生物大分子

  39. SARS病毒N蛋白整体分子量 2-DE凝胶蛋白质斑点的检测 • 通过质谱分析，可以获得分析样品的分子量、分子式、分子中同位素构成和分子结构等多方面的信息

  40. 蛋白质功能研究技术

  41. 蛋白质功能研究技术 • 酵母双杂交

  42. 蛋白质功能研究技术 • Co-IP技术

  43. 蛋白质功能研究技术 • Co-IP&Pull down

  44. 蛋白质组在医学研究中的现状和前景

  45. 蛋白质组在医学研究中的现状和前景 • 人类疾病的蛋白质组研究 • 直肠癌： Sanchez等对15例结肠癌和13例正常人的结肠上皮进行2-DE。建立了包括882和861个斑点的结肠癌及正常人结肠粘膜的标准胶图。结果发现在分子量为13kD和pI值为5.6处的蛋白质仅出现在结肠癌的组织中。经鉴定为：钙粒蛋白B（calgranulin B）及钙卫蛋白（calprotectin）

  46. 蛋白质组在医学研究中的现状和前景 • 人类疾病的蛋白质组研究 • 肝癌 --- 醛糖还原酶 • 膀胱癌 ---醛糖还原酶 、Trp-tRNA合成酶、IFN-γ诱导的r3，SOD及35.8kD和11.2kD两未知蛋白 • 扩张型心肌病 --- 8种蛋白质

  47. 蛋白质组在医学研究中的现状和前景 • 致病微生物的蛋白质组研究 • 检测博氏疏螺旋体与免疫有关的蛋白质 • 弓形体抗原的检测 • 白色念珠菌 ----对真菌细胞壁蛋白分析筛选抗药真菌药物

  48. 蛋白质组学研究趋势

  49. 蛋白质组学研究趋势 • 在应用研究方面 • 蛋白质组学将成为寻找疾病分子标记和药物靶标最有效的方法之一 • 在技术发展方面 • 研究方法将更强调各种方法间的整合和互补，以适应不同蛋白质的不同特征 • 蛋白质组学与其它学科的交叉互动

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