Appunti di Microbiologia

1. Informazioni: Prof Eugenio Debbia Università di Genova Facoltà di Medicina e Chirurgia DISC-Sezione di Microbiologia, Largo Rosanna Benzi 10,16132 Genova Tel: 010-353 38136, 338 8805 256 329 260 5218 FAX: +39-010-353 7651 http://www.microbiologia.unige.it/ e-mail: eugenio.debbia@unige.it Appunti di Microbiologia W. Churchill

2. MICROBIOLOGIA • Batteri • Virus • Miceti • Protozoi e altri parassiti

4. BATTERI dimensioni Cellula Eucariotica Cellula procariotica Nucleo

5. STRUTTURA INTERNA DELLA CELLULA MICROBICA a) CELLULA PROCARIOTICA b) CELLULA EUCARIOTICA Membrana citoplasmatica Reticolo endoplasmatico Nucleoide Citoplasma Ribosomi Ribosomi Nucleo Nucleolo Membrana nucleare plasmide Citoplasma Parete cellulare Membrana citoplasmatica Mitocondrio Cloroplasto

6. Composizione: H2O (80%), K, Na, Mg, Ca, Fe, Zn, P, S e macromolecole organiche localizzazione delle macromolecole nella cellula batterica Parete Membrana Flagello Citoplasma Polisaccaridi Proteine Granuli D’accumulo Ribosomi Nucleoide Acidi nucleici Lipidi

10. IL MICROSCOPIO OTTICO • Vite macrometrica:è la  manopola di regolazione grossolana della messa a fuoco. • Vite micrometrica: permette la regolazione fine della messa a fuoco.  • Regolatore dell’intensità luminosa:permette di variare l’intensità luminosa del campo.

11. COLORAZIONE semplice DELLE CELLULE PER L’OSSERVAZIONE MICROSCOPICA Strisciare la coltura su un vetrino Formando uno strato sottile Ricoprire il vetrino con colorante Risciacquare e asciugare Asciugare all’aria 100x Vetrino Olio Porre una goccia d’olio (da immersione) sul vetrino; osservare con l’obiettivo 100x Passare il vetrino sulla fiamma per fissare il campione

12. COLORAZIONE DI GRAM (complessa o differenziale) Ricoprire lo striscio fissato al calore con cristal-violetto per 2-3 minuti Fase 1 Tutte le cellule si coloreranno di viola Fase 2 Aggiungere soluzione iodata per 1 minuto Le cellule rimarranno viola Fase 3 Decolorare in alcool per circa 1-2 minuti Le celluleGram-positive risulteranno viola, quelle Gram-negative incolori Colorare con fucsina per 1-2 minuti Fase 4 G- Le celluleGram-positive (G+) risulteranno viola, quelleGram-negative (G-) avranno una tonalità da rosa a rosso G+

13. La colorazione di Gram Un Gram positivo Un Gram negativo Un Gram positivo Cocchi Gram positivi Cocchi Gram positivi Bastoncelli Gram negativi misti a cocchi Gram positivi

15. Colorazione di Ziehl-Neelsen(bacilli alcool-acido resistenti) • Fucsina fenicata a caldo 5 m • Acido solforico (20%) 30’’ • Alcool 30’’ • Blu di metilene 1 m

16. Batteri alcool-acido resistenti: rossi su fondo blu azzurro

17. Osservazione a contrasto di fase Un lievito (S. cerevisiae), 400x Un batterio (L. sakei), 400x Una muffa (G. candidum), 400x Un attinomicete 400x Un lievito (Y. lipolytica) 400x Una muffa (R. oligosporus), 400x

18. Osservazione in campo scuro

19. Anatomia della cellula batterica • Schematicamente dall'esterno verso l'interno i batteri presentano: • a) glicocalice o slime • b) capsula • c) flagelli, pili o fimbrie • d) involucro (parete in generale) totalmente diverso tra gram-positivi e gram-negativi (tale differenza è messa in rilievo proprio dalla colorazione di Gram) • e) membrana citoplasmatica • f) mesosomi • g) citoplasma • cromosoma o altro materiale genetico accessorio: es. plasmidi. • ribosomi • corpi inclusi

20. Glicocalice • Materiale stratificato intorno alla cellula • Strato S: distribuzione regolare (cristallina) di sub-unità glicoproteiche • Capsula: matrice fibrosa costituita da polimeri di carboidrati

21. Flagelli • Moto browniano • Movimento attivo • Flagello: unico filamento sprovvisto • di membrana – flagellina- • (diversa in specie batteriche diverse) • chemiotassi

22. STRUTTURA DI UN FLAGELLO BATTERICO Filamento Flagellina Uncino Membrana Esterna LPS Anello L Anello P Peptidoglicano Periplasma Anello MS Membrana citoplasmatica Proteina Fli invertitore del motore Proteina Mot

24. Pili o Fimbrie • Le fimbrie sono appendici diverse dai flagelli, sono costituite da una proteina detta pilina che gioca un ruolo fondamentale nel processo di adesione dei batteri ad altre cellule (patogenicità). Spesso sono codificati dai plasmidi (vedi oltre) sia come fimbrie per l'adesività sia come pilo detto sessuale per creare un ponte citoplasmatico tra due cellule batteriche nei processi di coniugazione.

25. Morfologia delle adesine Afimbrial adhesin Type I fimbriae Type IV fimbriae (= bundle forming pilus) Curli

26. ADESINE BATTERICHE

28. La Parete (Cell-Wall) • E’ lo strato compreso tra la membrana citoplasmatica e la capsula • Gram+: peptidoglicano e ac. teicoici • Gram-: peptiglicano, lipoproteine, membrana esterna e lipolisaccaride (LPS) • Fornisce protezione osmotica (5-20 atm) entra in gioco nella divisione non ha permeabilità selettiva

29. RAPPRESENTAZIONE SCHEMATICA DELLA PARETE CELLULARE DEI GRAM POSITIVI E NEGATIVI Gram positivi Gram negativi Peptidoglicano Peptidoglicano Membrana Membrana citoplasmatica Periplasma Membrana esterna Lipopolisaccaridi e proteine

30. PARETE CELLULARE DEI GRAM POSITIVI Proteina associata alla parete Acido teicoico Acido lipoteicoico Peptidoglicano Membrana citoplasmatica

31. BATTERIO GRAM NEGATIVO Membrana esterna Membrana citoplasmatica Peptidoglicano

32. PARETE CELLULARE DEI GRAM NEGATIVI Polisaccaride O-specifico Core polisaccaridico Esterno Lipopolisaccaride (LPS) Porina Lipide A Membrana esterna Lipoproteina Fosfolipide Periplasma Peptidoglicano Membrana citoplasmastica Interno

34. Enzimi attivi sulla parete • Lisozima, contenuto nella saliva, lacrime e mucosa nasale, • Autolisine, contenute negli stessi batteri: glicosidasi, amidasi e peptidasi • (enzimi che intervengono sulla sintesi di parete).

35. Membrana citoplasmatica • Costituita da fosfolipidi e proteine, non contiene steroli (negli eucarioti) presenta invaginazioni: i mesosomi importanti nella formazione del setto vi è attaccato il DNA in certe specie su altri mesosomi vi è un sistema di trasporto attivo (fotosintesi, azoto)

36. Doppio strato fosfolipidico della Membrana Citoplasmatica batterica Lipidi 40% (steroli assenti, fosfolipidi ++) Acidi grassi Regione idrofila Regione idrofobica H2O Glicerolo Fosfato

37. STRUTTURA DELLA MEMBRANA CITOPLASMATICA Esterno Gruppi idrofilici Fosfolipidi Gruppi idrofobici Interno Molecola fosfolipidica Proteine integrali di membrana

38. Membrana citoplasmaticaFunzioni • permeabilità selettiva e trasporto, • trasporto elettroni e fosf. ossidativa • escrezione enzimi idrolitici • contiene enzimi e proteine (carrier) deputate alla sintesi del DNA, polimeri della parete, lipidi di membrana contiene recettori e proteine necessarie alla chemiotassi • Il 50% della membrana si presenta in uno stato semifluido dovuto alla grande attività per la crescita batterica

39. FUNZIONI DELLA MEMBRANA CITOPLASMATICA Barriera di permeabilità Previene dispersioni e funziona come centro di transito per il trasporto di nutrienti da e verso la cellula Sito di ancoraggio Siti di molte proteine coinvolte nel trasporto, nelle vie biosintetiche e nella chemiotassi Produzione dell’energia Enzimi della catena respiratoria Mesosomi ?

40. Forza motrice protonica: le reazioni biochimiche a livello di MC creano un eccesso di H+ all’esterno (gradiente) che tendono a rientrare. Attraverso ATPasi la cellula genera ATP.

42. Lo spazio periplasmico • E’ compreso tra la membrana interna e quella esterna, è riempito da un gel formato da peptidoglicano idratato. Diffusi nel gel vi sono inoltre proteine ed oligosaccaridi nonché proteine leganti specifici substrati, enzimi come la fosfatasi alcalina che reagendo con substrati li rendono trasportabili all’interno. Molti di questi composti intervengono nella regolazione della pressione osmotica, per esempio, cellule che crescono in ambiente ipotonico aumentano la sintesi di oligosaccaridi.

43. STRUTTURA DEL LIPOPOLISACCARIDE DEI BATTERI GRAM NEGATIVI Polisaccaride O-specifico Core polisaccaridico Lipide “A” Acidi grassi saturi

44. Struttura UNITA’ BASALE N-acetilglucosamina (G) Acido N-acetilmuramico (M) (1-6) Gruppo N-acetile Legame sensibile Al lisozima Legami peptidici L-alanina Acido D-glutammico D-alanina Acido Meso diaminopimelico

45. LEGAME TRA LE UNITA’ PEPTIDICHE E GLICANICHE NELLA FORMAZIONE DELLO STRATO DI PEPTIDOGLICANO Scheletro del glicano Peptidi Escherichia coli (Gram negativo) Staphylococcus aureus (Gram positivo)

47. Sistemi di secrezione(Gram-negativi) • sono NOTI SEI SISTEMI di esportazione di molecole effettrici nella membrana e citoplasma della cellula ospite della quale modulano ed alterano le funzioni per favorire la propria sopravvivenza e replicazione nei tessuti dell.ospite (49, 100, 293). L.energia necessaria per il trasporto del substrato è fornita da ATP per azione di ATPasi (tranne che nel sistema IV) situata nella faccia interna della membrana citoplasmica. Alla secrezione di molte proteine batteriche partecipano delle chaperonine che legano il substrato, ne impediscono la degradazione e ne orientano il passaggio attraverso i vari sistemi (5).

48. Sistemi di secrezione(Gram-negativi) • Tipo I: la proteina è direttamente liberata nell’ambiente attraverso una porina • Complesso trimerico ABC (ADP binding cassette) .one-step., cioè senza modifiche o clivaggi a • livello del periplasma, composto dal trasportatore ABC. La sequenza segnale è presente nel termine C della • proteina secreta. Esempio: (HlyB) + fattore accessorio (HlyD) + fattore addizionale della membrana esterna • (Tol C). È responsabile della secrezione dell.emolisina HlyA dell.E. coli, dell.adenilato ciclasi (B. pertussis), • leucotossina (P. haemolytica) proteasi (P. aeruginosa), e di altre tossine (107).

49. Sistemi di secrezione(Gram-negativi) • Tipo II: la proteina viene immessa nello spazio periplasmico quindi un vettore la porta all’esternoSistema (.two-step.) in cui avviene prima clivaggio della sequenza leader poi il passaggio, • attraverso la membrana interna tramite sistema sec e/o GSP (General Secretory pathway), nel periplasma, • quindi trasporto della proteina matura (troncata al termine .N) nella membrana esterna mediato da 12 • proteine presenti nella membrana interna (alcune simili a proteine dei pili tipo IV ed all.apparato .export. di • batteriofagi filamentosi ed alla proteina secretina del sistema III). Il canale di passaggio è proporzionato alle • dimensioni delle molecole (proteasi, lipasi, fosfo lipasi, cellulasi, pectinasi) o tossine da esportare, come la • 10 • tossina colerica (CTx), pullulanasi di K. oxytoca, aerolisina di A. hydrophila, e tossine di diverse specie • patogene appartenenti alla famiglie delle Legionelle, Enterobatteriacee, Pseudomonadacee (5).

50. Sistemi di secrezione(Gram-negativi) • TipoIII: la proteina è introdotta nella cellula bersaglio direttamente con un meccanismo tipo siringa • TIPO III: Sistema (.one step.) composto da un complesso di oltre 20 proteine che si assemblano in un • canale altamente regolato che attraversa la membrana interna, il periplasma e la membrana esterna, a guisa di • siringa munita di relativo ago da iniezione che penetra nella membrana della cellula bersaglio. Visibile al • microscopio elettronico come struttura similflagellare con corpo conformato a dischi sovrapposti e l.ago di • varia lunghezza a seconda della specie batterica (ad es., 50-588 nm. nei coli EPEC, molto più corto nelle • shigelle) (296bis). Questo sistema è usato da numerosi batteri, come: Salmonelle, Shigelle, Yersinie, E. coli • EPEC e EHEC, Legionelle, Vibrioni, Aeromonas, Chlamydia spp, B. bronchiseptica, Pseudomonas • aeruginosa, Erwinia (18, 37, 100, 148, 293, 294, 296bis, 353, 354). Il sistema delle Salmonelle è codificato • da tre isole cromosomiche di patogenicità (Quadro3). Nelle Shigelle i geni codificanti il sistema III sono • situati invece in un plasmide di 220 Kb.