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沉淀反应 PRECIPITATION

沉淀反应 PRECIPITATION. 概念. 沉淀反应 :( precipitation) 可溶性抗原与相应抗体，在适宜条件下 发生结合，出现的沉淀现象。. 液相内沉淀试验： 指抗原抗体在以生理盐水 或其它无机盐缓冲液为反应介质的液相内 自由接触，短时间可出现反应。. 凝胶内沉淀试验： 指琼脂糖内扩散或凝胶内 扩散试验。. 第一节 液相内沉淀试验. 一、絮状沉淀试验 : (flocculation test ) 二、 免疫浊度试验 : (immunoturbidimetry). 一、絮状沉淀试验.

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沉淀反应 PRECIPITATION

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Presentation Transcript

  1. 沉淀反应PRECIPITATION

  2. 概念 • 沉淀反应:(precipitation)可溶性抗原与相应抗体，在适宜条件下 • 发生结合，出现的沉淀现象。 • 液相内沉淀试验：指抗原抗体在以生理盐水 • 或其它无机盐缓冲液为反应介质的液相内 • 自由接触，短时间可出现反应。 • 凝胶内沉淀试验：指琼脂糖内扩散或凝胶内 • 扩散试验。

  3. 第一节 液相内沉淀试验 一、絮状沉淀试验:(flocculation test) 二、免疫浊度试验: (immunoturbidimetry)

  4. 一、絮状沉淀试验 ( flocculation test) • 原理 抗原溶液与相应抗体溶液混合，在电解质存在下，抗原与抗体结合出现可见的絮状沉淀。

  5. 在抗体浓度不变的情况下随着抗原浓度不断上升免疫沉淀反应变化如图在抗体浓度不变的情况下随着抗原浓度不断上升免疫沉淀反应变化如图

  6. 沉 示 图 絮 状 淀 意 各管抗原倍比稀释 Ag 加入抗血清 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 各管抗体量不变 Ab Ag 振摇 混匀、37℃孵育 沉淀量不同 轻摇 出现沉淀量最多的管为最适比例管。

  7. 方法评价： • 简便、敏感度较低 • 临床意义： • 测定抗原抗体反应 • 的最适比。

  8. 二、免疫浊度试验

  9. 透射比浊法和散射比浊法光路 透射比浊法 IC I 检测器A I0 θ 检测器B Iθ 散射比浊法

  10. 1.透射比浊法（transmission turbidimetry) 2.散射比浊法（nephelometry) ①速率散射比浊法(rate nephelometry) ②终点散射比浊法(endpoint nephelometry)

  11. （一）透射比浊法 （transmission turbidimetry) • 原理 抗原与抗体在一定缓冲液中形成IC，当光线透过反应溶液时，由于溶液内复合物粒子对光线的反射和吸收，引起透射光减少，IC越多透射光越少，可用吸光度表示。

  12. 用于免疫沉淀反应的一些缺陷： • (1)溶液中存在的抗原－抗体复合物分子应足够大，分子太小则阻挡不了光线的通过。 • (2)溶液中的抗原－抗体复合物的数量要足够多。如果数量太小，溶液浊度变化太小，对光通量影响不大。 • (3) 透射比浊是依据透射光减弱的原理来定量的，因此只能测定抗原－抗体反应的第二阶段，检测仍需抗原－抗体温育反应时间，检测时间较长。

  13. （二）散射比浊法 （nephelometry) • 原理 在入射光的一定角度检测粒子发出的散射光，散射光的强度与IC的含量呈正比。

  14. 1.速率散射比浊法 (rate nephelometry) • 原理 抗原抗体结合反应的过程中，在单位时间内两者结合的速度即在抗原抗体反应达最高峰时，测定其IC形成的量。抗体过量时，峰值与抗原量呈正比。

  15. 速率峰的测定

  16. 速率峰的测定

  17. Measure the RATE After Antibody AdditionRate Nephelometry Scatter 3 2 Rate 1 Time 1. Buffer addition 2. Sample Addition 3. Antibody addition First derivative: rate of change of scatter over time;this is the SLOPE of the curve

  18. 在速率峰基础上完成的标准曲线 RATE CONCENTRATION

  19. 抗原过剩的测定

  20. 抗原过量自动检测 加入校正液 RATE of SCATTER 抗体过量时的反应 抗原过量时的反应 60 85 0 反应时间(秒)

  21. 方法评价： • 敏感度高 • 快速(不必达平衡） • 抗原抗体结合的动态测定，理论上测定不受本底散射信号的影响 • 可检测微量样品

  22. 2.终点散射比浊法 (endpoint nephelometry) • 原理 让抗原抗体作用一定时间，使其反应达到平衡后，测定其IC形成的量。IC的浊度不再受时间的影响，但反应IC聚合产生絮状沉淀之前，进行浊度测定。

  23. 用于免疫沉淀反应的缺陷 (1)因为是一次性测定光吸收值，没有考虑每一个待测样本的吸收和散射效果，可测定结果不准确 (2)测定的仍是抗原－抗体反应的第二阶段，不适合快速检测。 (3) 终点法存在反应本底，测定样本的含量越低，本底比例越大，故在微量测定时，本底的干扰是影响准确测定的重要因素。

  24. 影响免疫比浊测定的因素 • 1、抗原抗体比例 • 2、抗体的质量 抗体的特异性、效价、亲和力、R型和H型抗体 • 3、反应的溶液 • 4、增浊剂的使用

  25. Beckmancoulter IMMAGE双光径免疫浊度分析仪 第一光径：速率散射法，670nm波长，90度检测角，激光光源测定小分子物质。 第二光径：近红外颗粒速率免疫分析法，940nm波长，180度检测角，LED光源测定中、大型分子。

  26. 设计特点 • (1)方法学的选择： Immage检测仪除保留了原有的速率散射比浊法外，新增加了近红外速率透射比浊分析，以使检测范围进一步扩大，检测敏感性和准确性进一步提高。 • (2)抗原过量的检测：对反应介质中PEG对血浆样本中其它蛋白质类物质发生非特异沉淀作用而引起的非特异干扰信号的出现作出了新的防范处理。

  27. (3)新的检测项目和方法： 四种方法分别是：速率散射比浊法、速率免疫抑制法、近红外颗粒速率免疫分析法、近红外颗粒速率散射抑制法。 其中速率散射比浊法和近红外颗粒速率散射抑制法最主要用于体液（主要血浆）中小分子药物浓度的检测。这些方法的合理使用，使Immage进一步扩大了检测菜单。

  28. 检测项目分类组合： • (一)心血管疾病　　　　　　(二)血液病检测项目：　　　　　　　　　　检测项目：载脂蛋白A-1　　　　　　　　　　抗凝血酶III载脂蛋白B转铁蛋白脂蛋白(a)触珠蛋白超敏CRPB因子

  29. (三)肾功能监测　　　　　　　　(四)神经系统疾病检测项目　　　　　　　　　　　　检测项目：尿微量白蛋白　　　　　　　　　　白蛋白转铁蛋白　　　　　　　　　　　　α2-巨球蛋白α2-巨球蛋白　　　　　　　　　　IgA、IgG、IgMβ2-微球蛋白　　　　　　　　　　　　　　α1-微球蛋白IgG,IgA痕迹蛋白(三)肾功能监测　　　　　　　　(四)神经系统疾病检测项目　　　　　　　　　　　　检测项目：尿微量白蛋白　　　　　　　　　　白蛋白转铁蛋白　　　　　　　　　　　　α2-巨球蛋白α2-巨球蛋白　　　　　　　　　　IgA、IgG、IgMβ2-微球蛋白　　　　　　　　　　　　　　α1-微球蛋白IgG,IgA痕迹蛋白

  30. (五)免疫功能障碍　　　　　　(六)营养状态监测免疫球蛋白A　　　　　　　　　　检测项目：免疫球蛋白G　　　　　　　　　　白蛋白免疫球蛋白M　　　　　　　　　　前白蛋白免疫球蛋白E　　　　　　　　　　转铁蛋白lgG亚型　　　　　　　　　　　　铁蛋白κ轻链/游离κ轻连　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　λ轻链/游离λ轻连补体C3补体C4C-反应蛋白(CRP)(五)免疫功能障碍　　　　　　(六)营养状态监测免疫球蛋白A　　　　　　　　　　检测项目：免疫球蛋白G　　　　　　　　　　白蛋白免疫球蛋白M　　　　　　　　　　前白蛋白免疫球蛋白E　　　　　　　　　　转铁蛋白lgG亚型　　　　　　　　　　　　铁蛋白κ轻链/游离κ轻连　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　λ轻链/游离λ轻连补体C3补体C4C-反应蛋白(CRP)

  31. (七)炎症状况监测　　　　　　(八)类风湿性关节炎检测项目：　　　　　　　　　　检测项目C-反应蛋白　　　　　　　　　　类风湿因子α1-酸性糖蛋白　　　　　　　　C-反应蛋白触珠蛋白　　　　　　　　　　　　抗链球菌溶血素O铜蓝蛋白DNase-B(七)炎症状况监测　　　　　　(八)类风湿性关节炎检测项目：　　　　　　　　　　检测项目C-反应蛋白　　　　　　　　　　类风湿因子α1-酸性糖蛋白　　　　　　　　C-反应蛋白触珠蛋白　　　　　　　　　　　　抗链球菌溶血素O铜蓝蛋白DNase-B

  32. (九)肝脏疾病　　　　　　　　(十)新生儿体检α1-抗胰蛋白酶　　　　　　　　α1-抗胰蛋白酶抗凝血酶ⅢC-反应蛋白铜蓝蛋白　　　　　　　　　　前白蛋白补体C3、C4免疫球蛋白A、M(九)肝脏疾病　　　　　　　　(十)新生儿体检α1-抗胰蛋白酶　　　　　　　　α1-抗胰蛋白酶抗凝血酶ⅢC-反应蛋白铜蓝蛋白　　　　　　　　　　前白蛋白补体C3、C4免疫球蛋白A、M

  33. （十一）药物浓度地高辛卡马西平苯巴比妥茶碱采布霉素苯妥因VPA庆大霉素（十一）药物浓度地高辛卡马西平苯巴比妥茶碱采布霉素苯妥因VPA庆大霉素

  34. 第二节 凝胶内沉淀试验 一、单向琼脂扩散试验: (single gel diffusion test) 试管法 平板法 二、双向琼脂扩散试验： (double gel diffusion test)

  35. 单向琼脂扩散试验 试管法 Ag Ab

  36. 方法评价： • 敏感度较低、简便、 • 快速、实用、只能 • 定性不能定量、缺 • 乏多对分辨力。 • 原理 把抗原液小心地加于已含抗体琼脂的细试管内，当对应的抗原与抗体相遇，在界面处形成清晰的乳白色沉淀环。 • 临床意义： • 排泄物和组织匀浆中的细菌、寄生虫、螺旋体的检测。

  37. 平板法 • 原理 将一定量的抗体混入琼脂凝胶中，使待测抗原在凝胶中自由扩散，与相应抗体结合形成沉淀环，沉淀环大小与抗原浓度呈正相关。 标准品抗原浓度测定 不同病人抗原浓度测定

  38. 绘制标准曲线 1.测定沉淀环直径 2.在标准曲线上查找 相应抗原浓度

  39. 影响因素 1.抗原分子量：与扩散速度、沉淀环反相关 2.抗体种类：兔抗血清优于马、羊 3.抗体稀释度：抗体浓度大沉淀环小 4.扩散时间：抗原含量高，扩散时间长 5.扩散温度：4～37℃内温度与扩散速度正相关 6.琼脂板厚度：与沉淀环反相关

  40. 二、双向琼脂扩散试验 (double gel diffusion test) • 原理 将可溶性抗原和抗体置于琼脂凝胶板的对应孔中，两者各自在凝胶中向四周自由扩散，当抗原与抗体相遇，在比例合适时形成沉淀线。

  41. 原理示意图 模拟图 Ag Ab 1.抗原抗体双向自由扩散 2.24小时出结果 3.呈现沉淀线或弧 染色标本图

  42. 双向琼扩散试验的应用 1.检测未知抗原或抗体 2.抗原性质分析 3.抗体效价滴定 4.抗原或抗体纯度鉴定

  43. A B C D E F Ag Ab A: 浓度Ag、Ab及扩散率近似； 检测未知抗原或抗体 B：浓度Ag、Ab近似，扩散率Ag＞Ab ； C：浓度Ag、Ab近似，扩散率Ag＜Ab ； D：浓度Ag＞Ab，扩散率近似； E：浓度Ag＞Ab，扩散率Ag＞Ab ； F：浓度Ag＜Ab，扩散率Ag＜Ab ；

  44. 2.抗原性质分析 1表示待检Ag 2表示标准Ag 待检Ag与标准抗原完全吻合 待检Ag中含有与标准Ag相同的Ag；还有另外的Ag与Ab相对应 抗原性质分析 待检Ag有与Ab相对应的Ag，但与标准Ag不同 待检Ag与标准Ag性质相同；但含量较低；

  45. 抗体效价滴定 1.周围6个孔放不同稀释度的相应Ab。 2.以出现沉淀线的血清最高稀释倍数为 该抗体的效价。 3.可进行任意稀释。

  46. 抗原抗体纯度鉴定 “1”为单一抗原抗体系统。 “n”为多个抗原抗体系统。 *可以用混合抗原鉴定抗体纯度。 *可以用混合抗体鉴定抗原纯度。

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