Cromatografia Gasosa de Lipídios como Ferramenta para Estudos de Ecologia Microbiana

1. Cromatografia Gasosa de Lipídios como Ferramenta para Estudos de Ecologia Microbiana Marcelo Ferreira Fernandes

2. Resumo • Parte I. Ecologia Microbiana • Parte II. Diversidade Genética, Estrutural e da Composição Química de Lipídios em Microrganismos • Parte III. Lipídios como Ferramenta para Estudos de Ecologia Microbiana

3. PARTE IEcologia Microbiana

4. Ecologia Microbiana • Objetivos: • Entender a biodiversidade de microrganismos na natureza e como diferentes guildas interagem em comunidades microbianas • Medir a atividade dos microrganismos na natureza e monitorar seus efeitos sobre o ecossistema (componentes bióticos e abióticos)

5. Interações entre Microrganismos e Impactos Ambientais e Econômicos Derivados de suas Atividades

6. O Exemplo do Ciclo do Nitrogênio N2 (80% atmosfera) N N

7. Outros Exemplos de Impactos Ambientais e Econômicos Derivados da Atividade de Microrganismos

8. Controle da disponibilidade de nutrientes minerais para as plantas • Ciclagem de nutrientes, associações simbióticas (FBN, micorrizas), perdas de nutrientes • Seqüestro de carbono e balanço de gases de efeito estufa • Melhoria da qualidade física e química do solo • Formação de húmus, formação e estabilização de agregados de solo • Controle biológico de pragas e doenças vegetais e animais • Processos infecciosos (doenças) em plantas e animais • Decomposição de alimentos e outros bens • Biolixiviação de minerais de importância econômica (cobre, ouro, urânio...) • Biorremediação de xenobióticos (pesticidas, petróleo, explosivos, nylon...) • Tratamento de águas; eutroficação de águas e poluição de lençóis freáticos • Corrosão de metais, entupimento de tubulações de água e óleo • Produção de enzimas de importância industrial, fármacos, combustíveis, polímeros para plásticos biodegradáveis etc • ...

9. Fatores que Controlam Estes Processos e Impactos • Bióticos • Presença e atividade de uma guilda específica • Interações entre guildas • Abióticas

10. A Atividade do “Fator Biótico” Visa à Sobrevivência • Obtenção de energia ou de compostos para síntese celular • Ciclos biogeoquímicos (C, N, P, S, Fe, Mn, Hg...) • Associações simbióticas com plantas e animais • Patógenos, predadores e parasitas • Transformação de compostos tóxicos ao crescimento microbiano • Ciclos biogeoquímicos • Proteção contra fatores ambientais adversos • ...

11. Diversidade Metabólica Microbiana • Vasta diversidade de “modos de vida” ou de conseguir recursos para sobrevivência • Entre espécies de microrganismos • Dentro da mesma espécie

12. Obtenção de Energia (Aerobiose) • Corg → CO2 (Fungos, bactérias, protozoários...) • Decomposição de restos animais e vegetais • Formação do solo (CO2 + H2O H2CO3), formação de humus, ciclagem de nutrientes • NH4+ → N2O → NO → NO3- (Nitrosomonas, Nitrobacter...) • Contaminação de águas com NO3- • Gases de efeito estufa • Fe2+ → Fe3+ (Thiobacillus ferroxidans) • Biolixiviação de metais (cobre, ouro, urânio...) • CH4 + 2 O2 → CO2 + 2 H2O • Importante dreno de metano • So + H2O + 1 ½ O2 → SO42- + 2 H+ (Thiobacillus, Beggiatoa...) • Solubilização de fosfatos de rocha pela acidificação do solo, corrosão de estruturas metálicas... • 2 H2 + O2 → 2H2O (Alcaligenes, Ralstonia...) • CO + ½ O2 → CO2 (carboxidotróficas: Pseudomonas carboxydovorans) • Principal dreno de monóxido de carbono da Terra

13. Obtenção de Energia (Anaerobiose: Aceptores de Elétrons) • CO2 → CH4 (Arqueas metanogênicas: Methanobacterium, Methanococcus) • Gás de efeito estufa e combustível • NO3- → NO → N2O → N2 (Alcaligenes, Pseudomonas...) • Perda de fertilizantes • Gases de efeito estufa • Fe3+ → Fe2+ (Geobacter, Shewanella, Geospirillum, Thiobacillus ferroxidans, Sulfolobus...) • Degradação de compostos aromáticos (benzoato, toleno) utilizados como fonte de energia (doadores de elétrons) • Biolixiviação de metais de sulfetos metálicos. • SO42- + acetato ou H2 → H2S (Desulfovibrio, Desulfobacter...) • Toxidez à vida aquática • Desclorinação redutiva de pesticidas clorados

14. Obtenção de Compostos para Síntese e Metabolismo Celulares • Fotoautotrofia (algas, cianobactérias, Euglena) • Fixação de CO2, via luz • Quimoautotrofia (muitas bactérias e arqueas) • Fixação de CO2, via oxidação de compostos minerais • Heterotrofia (fungos, protozoários, bactérias, arqueas) • C orgânico (saprofitismo, simbiose, parasitismo ou predação) • Fixação Biológica doN2 (algumas bactérias) • N2 NH4+ • ... • ... Dinitrogenase

15. Interações entre Guildas Microbianas • Rizóbios (fixadores simbióticos de N2) vs. actinomicetos (produtores de antibióticos) → controle do processo da FBN em soja • Fermentadores (diversos mcgs) vs. metanogênicos (arqueas anaeróbicas) vs. metanotróficos (bactérias anaeróbicas): balanço de metano entre solo e atmosfera → controle do processo de efeito estufa • CO2 CH4 H2

16. Fatores Abióticos de Controle da Atividade, Biomassa e Composição de Comunidades Microbianas

17. Atividade, Biomassa e Composição Microbianas são Afetadas por: • Disponibilidade de oxigênio • De modo geral, bactérias e arqueas mais versáteis que eucariotos • Disponibilidade de água • Fungos e actinomicetos mais resistentes a seca • Holoarqueas = extremófilos Temperatura • Extremófilos = poucas bactérias; ultra-extremófilos = muitas arqueas • Disponibilidade de nutrientes • Oligotróficos vs. copiotróficos • Disponibilidade de energia • pH • Fungos = ácido; bactérias = neutro (Extremos em Arquea e Bacterias) • Toxidez por produtos naturais e artificiais • Interações biológicas...

18. Impactos Antropogênicos sobre a Microbiota e Processos Associados • Preparo do solo: • aeração, temperatura, umidade, pH • Pesticidas e outros compostos químicos: • toxidez seletiva ou geral • Culturas, sistemas de culturas, mudanças de uso da terra • quantidade e qualidade de substrato, relações hospedeiro e microrganismos, temperatura e umidade • Adubações e calagem: • disponibilidade de nutrientes, pH... • Irrigação e drenagem: • disponibilidade de água, temperatura e oxigênio... • Pecuária: • disponibilidade de nutrientes, oxigênio... • Deposições atmosféricas industriais: • disponibilidade de nutrientes, pH...

19. Exemplos de Impactos de Atividades Humanas sobre a Atividade, Biomassa e Composição das Comunidades Microbianas

20. Mudança do Uso da Terra • Substituição de florestas por pastagens: • Pisoteio animal → compactação do solo → reduz fluxo de oxigênio para o solo • Ambiente aeróbico → anaeróbico • Favorecimento de metanogênicos em detrimento de metanotróficos • Aumento da emissão de CH4 para a atmosfera • Remoção da cobertura vegetal → maior incidência solar → dessecamento da superfície do solo • Limitação de água na superfície, mas não no subsolo • Menor atividade de metanotróficos • Aumento da emissão de CH4 para a atmosfera

22. Ecologia Microbiana Atividades Humanas Meio Ambiente Atividades Microbianas

23. PARTE IIDiversidade Genética, Estrutural e da Composição Química de Lipídios em Microrganismos

24. De Onde Vem a Capacidade dos Microrganismos de Realizar Tantas Funções e de se Adaptar a Tantos Ambientes Distintos?

25. Diversidade Genética • “Alta diversidade de genes” • Diversidade metabólica potencial determinada pelos genes de cada espécie. • Evolução cria novos genes a partir de outros existentes • Acúmulo de genes diferentes do ancestral: nova sps. • Taxonomia molecular baseada em similaridade nas seqüências de genes • Seqüências rRNA (Woese, 1990) • Três domínios muito distintos • Bacteria • Archea • Eukarya

26. Árvore da Vida (Woese, 1990)

27. Evolução, estruturas celulares e composições de macromoléculas • Além de gerar diversidade metabólica, a evolução genética resultou em diferenças marcantes em estruturas celulares e composições de macromoléculas entre grupos taxonômicos de microganismos: • Ex: parede celular e estrutura química dos lipídios

28. Estruturas Celulares Microbianas Ricas em Lipídios Bactérias Gram + Bactérias Gram - MP* MP* PC (Peptidoglicano) Peptidoglicano Membrana Externa* PC Fungos e Algas Protozoários MP* MP* PC (Fungos: Quitina) (Algas: Celulose, glicoproteínas)

29. Estruturas Celulares Microbianas Ricas em Lipídios (cont.) Achaea MP* PC (Pseudpeptidoglicano ou glicoproteínas ou proteínas ou polissacarídeos)

30. Bacteria

31. Bacteria

32. Archaea

33. Eucarya

34. PARTE IIILipídios como Ferramenta para Estudos de Ecologia Microbiana

35. Ecologia Microbiana Aspectos de Interesse • Biomassa microbiana • Atividade microbiana • Composição ou estrutura da comunidade

36. Métodos para Investigação da Estrutura da Comunidade Microbiana • Dependentes de cultivo • Meios seletivos para organismos de interesse • Plaqueamento da amostra em meio de cultura sólido • Enumeração e identificação de microrganismos

37. Organismos Cultiváveis Fungos Actinomicetos Protozoários, Algas Archaea Bactéria

39. Organismos Viáveis, Não-Cultiváveis • Torsvik, V. et al. High Diversity in DNA of Soil Bacteria. Applied and Environmental Microbiology, 56(3):782-787, 1990. • Apenas 1 a 10% dos microrganismos na natureza são cultiváveis em laboratório; • Embora não cultiváveis, esses organismos são ativos na natureza; • Exemplos de impacto: • Morris et al. (Nature, 2002): • SAR 11, ser vivo mais abundante do planeta, não-cultivável. • Nitrificação: • Bactérias Nitrosomonas e Nitrobacter (Winogradsky, 1888) • Wuchter et al. (PNAS, 2006): • Archaea (Crenarchaeota): 100-1000 x mais abundante que bactérias nos oceanos • Leininger et al. (Nature, 2006): • Archaea (Crenarchaeota): ~3000x mais abundante que bactérias no solo

40. Métodos de Investigação da Comunidade Microbiana Independentes de Cultivo

41. Métodos Independentes de Cultivo • DNA • taxons e funções mais específicos • Primers específicos para grupos taxonômicos microbianos (rRNA) ou genes para enzimas relacionadas a uma determinada função (ex: bactérias nitrificantes = gene amo...) • Lipídios • em geral, compara grandes grupos taxonômicos de microrganismos • poucos marcadores para grupos funcionais específicos • em alguns casos, atividade de guilda com uma função específica pode ser investigada em associação com técnicas isotópicas • Marcador fenotípico

42. Métodos Baseados em DNA (opcional) • Extração do DNA da amostra ambiental • Amplificação de regiões específicas do DNA (PCR e primers específicos) • Taxonomia (rRNA) • Funções (genes específicos) • Padrão de bandas em gel de eletroforese • DGGE • LH-PCR • T-RFLP ... • Clonagem e seqüenciamento de fragmentos amplificados ou recuperados das bandas do gel • Identificação microbiana utilizando-se ferramentas de comparação de similaridades entre seqüências obtidas com as disponíveis em bancos de dados de seqüências de DNA (NCBI)

43. Métodos Baseados em Lipídios • Princípio de avaliação da estrutura das comunidades microbianas: • Diversidade Estrutural de Ácidos Graxos • Associação entre estrutura e grupos microbianos (biomarcadores microbianos) • Inferências sobre mudanças na estrutura da comunidade a partir de mudanças no perfil de ácidos graxos

44. Diversidade Química de Ácidos Microbianos ex: 18:26c Saturado (ex: 17:0) ex: 18:36c Poliinsaturado Monoinsaturado (ex: 18:19c) Ramificado(iso, iX:0) Ramificado(anteiso; aX:0) Ciclopropeno (ex: 19:0cy8c)

45. Nomenclatura dos Ácidos Graxos • X:Y • X = no de carbonos da molécula • Y = no de insaturações (duplas ligações) Ex: 16:0 (ácido hexadecanóico) • Se Y>0 (insaturados): • X:YZc, onde Z é a posição da primeira insaturação à partir do C distal, e “c” indica a conformação “cis”, e t, a “trans” Ex: 16:15c; 18:17t; 18:26c • iX:Y, aX:Y, X:Y 10-Me • Radical metil lateral na posição 2, 3 ou 10, a partir do C distal Ex: i15:0; a15:0; i17:0; 18:0 10-Me • X:Ycy Zc • cy representa presença de anel ciclopropeno Ex: 19:0cy 8c

46. Ácidos Graxos Biomarcadores • Grupos Taxonômicos • Poucos de Grupos Funcionais Específicos

47. Tipo FAME Grupo Microbiano Poliinsaturados 18:2ω6c Fungos Poliinsaturado 20:5ω6c Fungos micorrízicos arbusculares Poliinsaturado 20:4ω6c Protozoários, nematóides Metil C ω10 16:0 10Me; 17:0 10Me; 18:0 10Me Actinomicetos Metil C ω10 16:0 10Me Desulfobacter (redutoras do SO42-) Ciclopropil 17:0cy; 19:0cy Bactéria Gram negativas Iso/anteiso i15:0; a15:0; i16:0; i17:0, i17:0 Bactéria Gram positivas Monoinsaturado 18:1ω7c Bactéria Gram negativas Monoinsaturado 16:1ω5c (NLFA) Fungos micorrízicos arbusculares Monoinsaturado 16:1ω5c (PLFA) FMA, Flavobacterium/ Cytophaga Monoinsaturado ω8c 16:1ω8c, 18:1ω8c Bactérias metanotróficas Misto i17:1ω7c Desulfovibrio (redutoras do SO42-) Biomarcadores

48. Ácidos Graxos em Diferentes Classes de Lipídios Complexos • Ácidos graxos raramente ocorrem livres em células • Normalmente, eles integram lipídios estruturalmente mais complexos • Diferentes tipos de ligações químicas unem os ácidos graxos ao restante da molécula dos lipídios complexos

49. Ligações Químicas dos Ácidos Graxos • Lipídios com ligações éster • ex: triacilgliceróis • R-COO• • Lipídios com ligações éter • ex: plasmalógenos, Archaea • R-CH2O• • Lipídios com ligação amida • ex: esfingolipídios • R-CO • NH-R’

50. Éster Metílico de Ácido Graxo “Fatty Acid Methyl Ester”(FAME) Ácido Graxo R COOH Metanólise Alcalina Branda (PLFA e EL-FAME) ou Saponificação –Metanólise Ácida (MIDI) FAME Altamente volátil COOCH3