Proyecto Regional TCP

1. Proyecto Regional TCP/RLA/3107Desarrollo de Bases de Datos y Tablas de Composici�n de Alimentos de Argentina, Chile y Paraguay para fortalecer el comercio internacional y la protecci�n de los consumidores

2. Contenido de Agua y Materia Grasa Prof. Lilia Masson Salaue lmasson@ciq.uchile.cl Universidad de Chile, Facultad de Ciencias Qu�micas y Farmac�uticas , Centro de Investigaci�n y Desarrollo en Grasas y Aceites, CIDGRA Departamento de Ciencia de los Alimentos y Tecnolog�a Qu�mica,

3. M�todos de determinaci�n de agua en un alimento o bebida La determinaci�n del porcentaje de agua en un alimento natural o procesado tiene diversas connotaciones: 1.- Es la base de referencia para calcular su aporte energ�tico a partir de los porcentajes de macronutrientes: Prote�nas Hidratos de carbono Materia grasa: AG Sat. Monoinsat. Poliinsat. ?6, ?3, AG.trans, colesterol

4. Es la base del etiquetado nutricional en la expresi�n porcentual o por porci�n, no s�lo de macronutrientes sino de: - Cenizas o contenido mineral - Fibra dietaria - Micronutrientes: minerales y vitaminas - Componentes bioactivos

5. Informaci�n complementaria Contaminantes inorg�nicos y org�nicos Componentes t�xicos naturales o generados en el procesamiento

6. Importancia de su determinaci�n Es la base de referencia para: Caracterizar un alimento Comparar alimentos en base seca o a un contenido de agua fija pre-determinada Realizar estudios de variaciones estacionales que se producen en diversos alimentos, como peces grasos, en que la relaci�n agua, contenido graso es inversa, manteni�ndose constante el contenido proteico Extracci�n de materia grasa en alimentos frescos

7. M�todos de determinaci�n de humedad Los m�todos para determinar el contenido de agua en alimentos naturales y procesados se basan en la medida directa o indirecta del agua retirada de un alimento La medici�n de algunas propiedades f�sicas del alimento que cambian sistem�ticamente con el contenido de agua

8. La medici�n de la reactividad qu�mica del agua

9. M�todos de secado Los m�todos de secado son mas convenientes para alimentos que se est�n analizando con fines nutricionales La liofilizaci�n o secado por congelaci�n ofrece la ventaja que el agua se retira bajo condiciones muy suaves El tejido deshidratado puede emplearse para la determinaci�n de diversas sustancias y es f�cil de homogeneizar

10. El material liofilizado es liviano y f�cil de transportar Desventaja: Los liofilizadores son caros El agua residual debe retirarse de la muestra liofilizada por presi�n reducida O sobre desecantes adecuados Esto a�ade una segunda etapa en el an�lisis

11. El desecado de la muestra en estufa de vac�o entre 60 � 70�C es m�s eficiente, si una corriente de aire seco lenta se pasa a trav�s del horno. Tiene la ventaja que las porciones anal�ticas pueden mantenerse por un tiempo (toda la noche) antes de su posterior tratamiento

12. Requieren m�nima intervenci�n del personal del laboratorio Costos de capital bajos Este m�todo es preferible al secado en estufa de aire forzado a 100-105�C, un procedimiento ampliamente usado y de bajo costo

13. Secado en aire a presi�n normal No es conveniente para muchos alimentos Especialmente los con alto contenido de az�cares que puede caramelizar Grasas que pueden sufrir oxidaci�n o p�rdida de materias vol�tiles como aceites o aceites esenciales

14. Secado en microonda Ofrece la ventaja de la rapidez Requiere permanente vigilancia del personal del laboratorio para prevenir que la muestra se queme

15. M�todo termovolum�trico M�todo de destilaci�n por arrastre de vapor con tolueno o xilol de acuerdo a Dean y Stark Es aplicable a muchos alimentos y sobre todo a los que contienen cantidades significativas de compuestos vol�tiles diferentes al agua como las especias, que contienen aceites esenciales

16. M�todo qu�mico Karl Fisher. Tiene una exactitud mayor que la necesaria para un an�lisis nutricional de un alimento Es �til en alimentos de muy bajo contenido de agua, menos de 5 %, principalmente los higrosc�picos.

17. M�todos Instrumentales Se basan en una propiedad f�sica del alimento Alta velocidad en la obtenci�n de resultados Ej: NMR, NIR, Irefracci�n Se emplean en laboratorios que manejan un alto n�mero de muestras de alimentos similares Tienen mayor aplicaci�n en alimentos de humedad intermedia 5 - 20%. Requieren de una correcta calibraci�n contra un material de referencia conocido patr�n.

18. ADVERTENCIA! Todos los m�todos de secado liberan compuestos vol�tiles junto con el agua. Y deben hacerse correcciones por vol�tiles obvios como el etanol.

19. M�todos para determinar Materia grasa Grasa Total La grasa de un alimento consiste de un n�mero de diversos compuestos tanto unidos como libres. Encontrar un m�todo que como una entidad �nica. mida la � grasa total�, normalmente presenta bastante problemas

20. Por lo tanto, hay diversos m�todos disponibles y que se practican habitualmente en los laboratorios anal�ticos Los valores obtenidos por cada m�todo para � grasa total� dependen en gran medida del m�todo empleado, especialmente en el caso de alimentos bajos en grasa.

21. M�todos de extracci�n con solvente Soxhlet es de extracci�n discontinua Butt extracci�n continua Se debe trabajar sobre muestra seca en el laboratorio Tienen aplicaci�n limitada, no son los mas recomendados, dado que en muchos alimentos naturales y especialmente los procesados la materia grasa se une a carbohidratos y prote�nas

22. Hay muchos tejidos que contienen cantidades importantes de fosfol�pidos Gran consumo de tiempo Extracciones incompletas especialmente en cereales

23. Las muestras est�n sometidas a altas t� por tiempos prolongados No es recomendable para materias grasas altamente poliinsaturadas Es m�todo oficial para la extracci�n de aceite de semillas Variante M�todo Foss autom�tico usa tetracloro etileno para extraer la rasa r�pidamente Ha funcionado bien en productos c�rneos

24. Problemas adicionales Uso de solventes inflamables: �ter et�lico, �ter de petr�leo, hexano Son solventes t�xicos Los valores del extracto graso no son los mismos si se usa eter et�lico que es mas polar que hexano o �ter de petr�leo 40-60�C que son menos polares CONLUSI�N Empleo de M�todos alternativos

25. M�todos Alternativos Empleo de mezcla de solventes polares y no polares M�todo de Bligh y Dyer y de Folch Ambos extraen los l�pidos en forma m�s completa, pues extraen los fosfol�pidos Dependiendo de la muestra a veces se requiere una purificaci�n del extracto

26. Aplicaciones: En nuestra experiencia cuando se va a estudiar o a investigar los l�pidos del extracto, como composici�n en �cidos grasos, tocoferoles, fitosteroles, pigmentos carotenoides, clorofila, se recomienda aplicar estos M�todos. Para Alimentos aplicamos normalmente Bligh y Dyer Para fluidos biol�gicos: plasma. gl�bulos rojos Folch

27. Fundamento Cuando se tiene un alimento h�medo y se homogeniza con una mezcla de cloroformo metanol en determinadas proporciones, que son Cloroformo: Metanol : Agua 1:2:0.8 se forma entre los tres solvente un sistema miscible. Este sistema permite extraer los componentes lip�dicos del tejido, sean triglic�ridos, fosfol�pidos, derivados lip�dicos, etc. en su totalidad. Esta primera extracci�n exige que la matriz del alimento a extraer contenga 80% de humedad

28. Para lo cual es requisito indispensable determinar previamente el contenido de agua del alimento y ajustar a 80% en caso necesario Una vez efectuada la primera homogeneizaci�n y extracci�n simult�nea de la materia grasa del alimentos con la mezcla cloroformo, metanol, agua en la proporci�n se�alada, se desestabiliza esta mezcla homog�nea de solventes por adici�n de 1 parte adicional de cloroformo y 1 parte de agua, se llega a esta proporci�n: Cloroformo: Metanol: Agua = 2:2:1.8

29. En esta proporci�n se desestabiliza la mezcla terciaria de los tres solventes y se separa la capa clorof�rmica que disuelve los l�pidos y la fase agua /metanol que no disuelve l�pidos. Se descarta la capa metanol/ agua y los l�pidos quedan en la capa clorof�rmica

30. Se mide el volumen de cloroformo en una probeta adecuada, se toma una al�cuota, se evapora el cloroformo y se pesa el residuo para calcular el % de materia grasa. Otra alternativa es evaporar la totalidad el cloroformo en evaporador rotatorio empleando un matraz o bal�n tarado. Por diferencia de peso se obtiene el contenido graso extra�do y se calcula el % de grasa de la muestra

31. El M�todo de Folch que se basa en el mismo principio lo aplicamos para extraer los l�pidos de flu�dos biol�gicos como plasma, suero, o de elementos figurados como membrana de gl�bulos rojos. En este caso los fluidos tienen del orden de 80% de humedad y no se requiere el ajuste

32. En el caso de determinar contenido graso en alimentos que tienen los l�pidos unidos a hidratos de carbono y/o prote�nas, como es el caso de los alimentos procesados sometidos a altas t� como horneado, fritura, deshidratado, extru�do, etc, nosotros aplicamos m�todo de hidr�lisis �cida. La muestra fresca homogeneizada se pesa, se trata con alcohol, se calienta en ba�o de agua entre 70-80�C por 20 minutos para hidrolizar las uniones proteicas y de hidratos de carbono que tienen incluida la materia grasa y no hidrolizar la uni�n �ster del �cido graso con el glicerol que constituye los triglic�ridos

33. Luego de la hidr�lisis, el l�quido se traslada a embudo de decantaci�n o tubo de Mojonnier para proceder a la extracci�n de la materia grasa con �ter et�lico y �ter de petr�leo. Los extractos et�reos se separan por decantaci�n, hay que tener cuidado con la formaci�n de emulsiones. Los extractos et�reos se reciben en matraz tarado, se evapora el solvente en evaporador rotatorio y el residuo obtenido libre de solventes se pesa. Se controla peso constante por gaseado con Nitr�geno. Se calcula el % de grasa de la muestra

34. APLICACIONES Nosotros lo aplicamos a todo tipo de alimentos: carnes, embutidos, queso, galletas, harinas, alimentos formulados, chocolate, alimentos fritos, horneados, extru�dos, etc. Es un m�todo universal, pero puede haber limitaciones en alimentos muy ricos en az�car y en otros casos, una descomposici�n de fosfol�pidos. M�todo Oficial de la AOAC para varios alimentos No lo aplicamos cuando se va a estudiar posteriormente los l�pidos extra�dos del alimento

35. M�todo de Hidr�lisis Alcalina Aplicaci�n principal en Leche y derivados l�cteos Fundamento: Los gl�bulos de grasa est�n rodeados de una pel�cula de fosfol�pidos que impide la extracci�n directa de la grasa con un solvente Esta capa de fosfol�pidos se destruye con un �lcali suave como es una soluci�n de amon�aco dilu�da

36. La muestra se transfiere a un embudo de decantaci�n y se extrae de acuerdo al procedimiento con los solventes org�nicos. Los extractos se reciben en matraz tarado, se evapora el solvente en evaporador rotatorio y se controla peso constante por diferencia de pesada. Se calcula el % de materia grasa de la muestsra. Este m�todo est� aprobado internacionalmente AOAC, FIL, para leche derivados l�cteos

37. M�todos Instrumentales FT NIR Aplica la espectroscopia Infrarroja cercana para medir contenido graso en algunas matrices. Necesita calibraci�n contra m�todo oficial aplicado en la misma matriz. NMR Se ha desarrollado un m�todo por NMR para medir contenido graso en semillas oleaginosas. Es muy r�pido, requiere calibraci�n con las respectivas semillas. Ambos son equipos de costo elevado

51. DETERMINACI�N DE ACIDOS GRASOS SATURADOS,MONOINSATURADOS, POLIINSATURADOS Y ACIDOS GRASOS TRANSM�todo Cromatograf�a Gaseosa (GC-FID)

52. 1.0 OBJETIVODeterminar el perfil de los �cidos grasos, incluidos los is�meros trans en grasas y aceites de origen vegetal y animal.2.0 CAMPO DE APLICACIONEl m�todo est� dise�ado para evaluar el perfil de �cidos grasos en aceites y grasas vegetales y animales.3.0 FUNDAMENTOLos �cidos grasos metilados de las muestras son separados y cuantificados por cromatograf�a gaseosa con detector FID en columna capilar de fase reversa.4.0 REFERENCIASISO 15304 �Animal and vegetable fats and oils � Determination of the content of trans fatty acid isomers of vegetable fats and oils � Gas chromatographic method.

53. 5.0 TERMINOLOG�AAcidos grasos trans: is�meros de configuraci�n trans de todos aquellos �cidos grasos que contienen dobles enlaces.6.0 MATERIALES INSUMOS Y EQUIPOS6.1 MATERIALES Y EQUIPOS6.1.1 Cromat�grafo de gases equipado con detector FID, muestreador autom�tico e hidr�geno como gas carrier.6.1.2 Balanza de precisi�n 0.001 g6.1.3 Agitador mec�nico de tubos6.1.4 Micropipetas de 1000 �L6.1.5 Viales con tapa de 2 mL para autosampler6.1.6 Columna capilar DB-23 fase reversa, 60 m, 0.25 �m i.d., 0.25 mm de film.6.1.7 Tubo de vidrio tapa rosca de 10 mL

54. 6.2 REACTIVOS6.2.1 �ter de petr�leo p.a.6.2.2 Soluci�n de hidr�xido de potasio en metanol 2 M6.2.3 Est�ndar Supelco, mezcla de 37 �steres met�licos de �cidos grasos.7 DESARROLLO DEL PROCESO7.1 Preparaci�n de las muestrasAntes de tomar la muestra, mezclar completamente. Fundir las muestras s�lidas para asegurar una buena homogeneizaci�n, a no m�s de 60 �C.7.2 Preparaci�n de los �steres met�licos:Pesar 250 mg de muestra en un tubo de vidrio con tapa rosca.Agregar 500 �L de hidr�xido de potasio en metanol 2 M. Agregar 5 mL de �ter de petr�leo.Agitar 2 min en vortex, reposar 1 hora.Trasvasijar a los viales del muestreador autom�tico .Inyectar.

55. 7.3 Determinaci�n7.3.1 Condiciones cromatogr�ficas T� detector: 250 �C T� inyector: 250 �C Programa de temperatura del horno: 120 �C por 5 min, aumentar la temperatura a raz�n de 10 �C/min hasta 180�C, mantener por 30 min. Aumentar nuevamente a raz�n de  10 �C/min hasta 210 �C y mantener por 21 min. (total 65 min). Flujo gas carrier: 15 psi Split: 1:100 Volumen de inyecci�n: 1 �L7.4 Expresi�n de resultados Para cuantificar los trans, hacer zoom en la zona de los C18, entre los 26 a 38 min. Considerar una altura de 33.000 a 55.000 �volt.

56. La fracci�n de masa relativa de cada �cido graso se calcula determinando el �rea corregida del peak correspondiente dividi�ndola por la suma de las �reas de todos los peaks.Aceites y grasas refinadas a alta temperatura: Calcular los is�meros trans como la suma de las fracciones de masa relativa de los esteres met�licos de C18:1 trans, C18:2 trans y C18:3 trans, relativos a todos los �steres met�licos de los acidos grasos. El maximo de peaks posibles de encontrar son C18:1 trans (1 peak), C18:2 trans (2 peak) y C18:3 trans (4 peak). Se expresa con 2 decimales.Aceites y grasas parcialmente hidrogenadas: Calcular los is�meros trans como la suma de todas las fracciones de masa relativa de todos los esteres met�licos de los �cidos grasos que contienen dobles enlaces con configuraci�n trans, relativo a la suma de los esteres met�licos de todos los �cidos grasos. Se expresan con 1 decimal.

57. OTRAS ALTERNATIVAS METODOL�GICAS Determinaci�n de �cidos grasos cis y trans en aceites y grasas hidrogenadas y refinadas por GLC capilar M�todo oficial AOCS Ce 1f-96. Emplea una fase l�quida estacionaria altamente polar. Los �steres met�licos de los �cidos grasos emergen de acuerdo a su largo de cadena (CL), grado de insaturaci�n (UN), geometria y posici�n de los dobles enlaces (DB(s)).

58. Fases l�quidas recomend. y condic.de trabajo Fases l�q: SP-2340 SP-2560 CP-SIL88 BPX70 Largo 60 m 50�100m 50-100m 50-120m t� C isoterm. 192 170 175 198 Puerta de inyecci�n 250�C ; Detector FID 250�C Pr.de entrada(kPa) 125 125 130 155 Veloc. linear gas cm/seg 15 16 19 17 Split 1:100 Carrier : helio, nitr�geno, hidr�geno Estandard interno Tridecanoina 5mg/mL en CHCL3 Vol. Iny.: 0.5-1.0ul; concentraci�n 7 mg/mL

59. METILACI�N M�todo BF3 de acuerdo a AOCS Ce 2-66 o IUPAC 2301. Muestras liquidas deben agitarse en�rgicamente antes de su an�lisis Muestras s�lidas deben fundirse antes de preparar los ME Siempre se trabaja sobre muestra de materia grasa anhidra

60. Definici�n de AGT A) Para t� altas : aceites refinados y grasas: Suma �cidos grasos C18:1t;C18:2t;C18:3t B) Para aceites y grasas parcialmente hidrogenadas Suma de todos los AGT que contengan DB La suma obtenida por este m�todo puede no dar el mismo valor obtenido por otros m�todos.

61. Cuantificaci�n Si se requiere expresion en mg/g debe agregarse el est�ndar interno antes de la metilaci�n y el c�lculo se hace en base a concentraci�n del estandar y �rea del acido graso . Si se est� examinando una mezcla compleja para el contenido individual de �cidos grasos para fines de etiquetado, el est�ndar interno se agrega al tubo de ensayo antes de la extracci�n.

62. Determinaci�n del contenido de is�meros AGT en grasas y aceites vegetales. ISO15304:2002(E) Antecedentes: Durante la refinaci�n (alta t�) desacidificaci�n y desodorizaci�n,se forman s�lo is�meros geom�tricos de los AG monoinsat y poliinsaturados, por lo tanto el doble enlace se mantiene en la misma posici�n, no hay migraci�n caso oleico C18:9c y elaidico C18:9t Durante el proceso de hidrogenaci�n se forman isomeros posicionales y trans

72. Calculo del contenido de AGT Aceites y grasas refinadas a alta t� Suma de las fracciones de masa relativas de los C18:1 trans, C18:2trans y C18:3 trans, relativas a los ME totales. C18:1 t 1 pic, C12:2 trans 2 pics, y C18:3, 4 pics. Aceites y grasas parcialmente hidrogenadas Suma de los fracciones de masa relativas de todos los AGT FAME que tengan dobles enlaces trans, relativo a todos los FAME