Stanovení enzymových aktivit

1. Stanovení enzymových aktivit

2. Jednotky enzymové aktivity • Katalytická aktivita (rychlost přeměny substrátu)  mol.s-1. Jednotkou katalytické aktivity je katal (kat). Pozor!!! • Reakční rychlost (fyzikálně-chemický smysl)  mol.l-1.s-1 • V praxi (např. při fotometrickém stanovení) měříme změny koncentrace v čase (tj. reakční rychlost)  pro vyjádření katalytické aktivity je nezbytné vztáhnout změřenou hodnotu na celkový objem

3. Jednotky enzymové aktivity • Donedávna byla katalytická aktivita (rychlost přeměny substrátu) vyjadřována v μmolech substrátu přeměněného za 1 minutu (1 U). • Vzájemný přepočet mezi U a kat 1 U = 1 μmol.min-1 = 1 μmol/60 s = 16,67 nmol. s-1 = 16,67 nkat

4. Jednotky enzymové aktivity • Koncentrace katalytické aktivity  kat.l-1 • Specifická katalytická aktivita  kat.kg-1 • Molární katalytická aktivita  kat.mol-1

5. Úprava vzorku před měřením • Nevhodné zpracování vzorku může vést ke zcela zkresleným výsledkům • Biologický materiál se zpracovává při 0 - 4 °C • Šetrná desintegrace a homogenizace vzorku (uvolnění intracelulárních enzymů) Elvehjem-Potterův homogenizátor • Centrifugace, úprava pH, ředění vzorku • Práce s multienzymovými systémy  zabránění nežádoucí proteolýzy (přídavek inhibitorů proteas) • Skladování v ledničce nebo mrazničce

6. Podmínky stanovení • Výsledek stanovení aktivity enzymu je závislý na použité metodě • Aktivity enzymů nutno měřit za přesně definovaných experimentálních podmínek • Podmínky měření je nutno optimalizovat (nejvhodnější typ pufru a jeho koncentrace, pH, iontová síla; přídavek aktivátorů, typ substrátu a jeho koncentrace, objem vzorku v reakční směsi …) • Enzymová reakce by měla probíhat pomalu  přeměna malého množství substrátu  konstantní rychlost reakce  naředění vzorku enzymu • Substrát ani pufr nesmí obsahovat kontaminující látky (detergenty, ionty těžkých kovů ......)

7. Teplota • Enzymové reakce jsou citlivé na změny teploty • Zvýšení teploty o 1 °C  zvýšení katalytické aktivity zhruba o 10 - 20 %  nutno dodržovat teplotu s přesností vyšší než 0,1 °C • Teplotní kvocient Q10 (udává, kolikrát se zvýší reakční rychlost, pokud teplota vzroste o 10 °C; většinou Q10 = 2) • Standardní teplota pro stanovení  30 °C • Často používaná teplota 37 ° může vést k postupné denaturaci enzymu • Enzymy z extremofilních organismů  odlišné teploty pro stanovení aktivity • Každý enzym vykazuje optimální teplotu pro svou aktivitu; její hodnota závisí na době měření (čím kratší doba stanovení, tím vyšší optimální teplota)

8. Teplota ovlivňuje • Stabilitu enzymu (je vyšší v přítomnosti substrátu nebo kompetitivního inhibitoru) • Ionizaci funkčních skupin • Afinitu substrátu k enzymu (k1 a k-1) • Rychlost štěpení komplexu ES (kcat) • Změna pH pufru • Rozpustnost O2

9. Optimální teplota enzymu • Hodnota záleží na době inkubace substrátu a enzymu • Čím je inkubace delší, tím je optimální teplota nižší

10. Tlumivé roztoky a pH • pH reakční směsi závisí na druhu pufru, iontové síle a teplotě • Dostatečně vysoká pufrační kapacita • Typ pufru ovlivňuje rychlost enzymové reakce (např. enzym je aktivován Ca2+ ionty  fosfátový pufr vytvoří obtížně rozpustný fosfát vápenatý  snížení enzymové aktivity) • Různé substráty pro jeden enzym  mohou vyžadovat různé pH • Různé enzymy vykazují různé pH optimum

11. Optimální pH enzymu • Každý enzym vykazuje maximální aktivitu v úzkém rozsahu pH (pH optimum) • pH optimum často odráží pH tělní tekutiny ve kterých se enzym nachází • Při reakci mimo pH optimum se snižuje enzymová aktivita

12. Volba substrátu • Sloučenina přeměňovaná za fysiologických podmínek • Syntetický substrát (obvykle levnější, stabilnější, dobře rozpustný, lépe definovaný...) • Pokud možno použití co nejvyšší koncentrace (malá změna koncentrace substrátu v průběhu reakce) • Možné problémy při použití přirozených substrátů (http://www.worthington-biochem.com/LY/default.html)

13. Volba substrátu Maximum activity Reaction Rate substrate concentration

14. Substráty pro proteasy • Přirozené substráty (proteiny) - rozpustné (kasein, hemoglobin, albumin) - nerozpustné (kolagen, keratin, fibrin) • Modifikované přirozené substráty - chromolytické (azokasein, barvená zesítěná želatina, barevný fibrin) • Syntetické substráty - chromogenní nízkomolekulární substráty (nitroanilidy, např. TAPA  tosyl-L-arginyl-p-nitroanilid); fluorescenční substráty, substráty značené radionuklidy

15. Aktivátory • Přítomnost aktivátorů zvyšuje enzymovou aktivitu • Přídavek divalentních iontů • Přídavek EDTA • Přídavek sloučenin obsahujících -SH

16. Přehled metod pro stanovení aktivit • Využívá se kinetická metoda (metoda založená na měření reakční rychlosti) • Reakční rychlost je ovlivněna řadou vnějších faktorů (pH, teplota, iontová síla, typ substrátu, typ pufru, přítomnost aktivátoru ...) • Reakční rychlost je funkcí koncentrace substrátu, enzymu, aktivátorů a inhibitorů • Všechny složky reakční směsi (kromě enzymu) musí být v přebytku  kinetika prvého řádu

17. Stanovení reakční rychlosti z průběhu reakce • Měří se změny koncentrace vybraného reaktantu (substrát, produkt, kofaktor ...) jako funkce času • Strmost této závislosti je úměrná aktivitě stanovovaného enzymu • Obvykle se měří změny fyzikálně-chemických parametrů jako je pH, absorbance, fluorescence ..., které se vynesou do grafu proti času

18. Citlivost reakce Citlivost reakce (schopnost detegovat malámnožství enzymu) může být zvýšena prodloužením inkubační doby 2 ug enzyme / ul [ produkt ] 1 ug enzyme / ul 0 čas 0

19. [ PN ] 0 time 0 Spontánní hydrolýza substrátu “spontánní” rychlost produkt substrát bez enzymu

20. Klasifikace metod pro stanovení enzymových aktivit • Optické - spektrofotometrie - fluorimetrie - polarimetrie - luminiscence • Manometrické • Elektrochemické - potenciometrie - ampérometrie - polarografie - konduktometrie • Radiometrické • Ostatní - viskozimetrie - mikrokalorimetrie - titrace

21. Spektrofotometrické metody • Některý z reaktantů nebo produktů má výrazné absorpční maximum v UV, VIS nebo IR oblasti, jímž se odlišuje od dalších látek • Raději měříme přírůstek absorbance • Snažíme se měřit při takové vlnové délce, kdy absorbuje pouze jedna složka směsi • Dáváme přednost měření složky s větším molárním koeficientem  větší citlivost • Vhodná instrumentace  dvoupaprskové přístroje umožňující kontinuální měření, s možností temperace

22. Spektrofotometrické metody • Nejvýznamnejší aplikace: NAD+ NADH + H+ Nárůst absorbance při 340 nm

23. Lamber-Beerův zákon Absorbance (A) = záporný dekadický logaritmus poměru zářivého toku propuštěného k dopadajícímu A = e . c . b • Využití pro kvantitativní analýzu: • Při znalosti e: c = A/e.b • Kalibrační přímka A c

24. Instrumentace

25. Fluorescenční metody • Citlivější než spektrofotometrické metody • Založeny na tvorbě fluoreskující sloučeniny v průběhu enzymové reakce lipasa dibutyrylfluorescein ---------- > fluorescein + kys. máselná

26. Fluorescenční metody • NADH i NADPH vykazují v alkalické oblasti silnou fluorescenci • Problém: - zhášení fluorescence vysoce absorbujícími molekulami (odnímají energii fluoreskujícím molekulám  snižují jejich fluorescenci) - interferující látky fluoreskující ve stejné oblasti

27. Manometrické techniky • Reakce při nichž se uvolňuje nebo spotřebovává plyn • Objemová změna se převádí na změnu tlakovou (práce při konstantním objemu) • Oxidoreduktasy (vývoj nebo spotřeba kyslíku) • Lyasy (vývoj nebo spotřeba CO2 a NH3) • Nevýhoda: pracné • Výhoda: možnost měření v suspenzích, tkáních, pletivech ...

28. Elektrochemické stanovení • Iontově selektivní elektrody - skleněná elektroda  změna pH (v praxi se pH udržuje konstatní, pH-statem se přidává kyselina nebo zásada) - elektrody měřící obsah plynného kyslíku (kyslíková elektroda) - elektrody pro NH3 a CO2

29. Radiometrické metody • Substrát značený radionuklidem • Po reakci je nutno oddělit radioaktivní produkt od zbylého substrátu (např. vysrážením, chromatograficky, elektroforeticky, extrakcí organickým rozpouštědlem, adsorbcí na vhodný adsorbent...) • Změření radioaktivity • Vysoká citlivost stanovení, možnost měření v kalných roztocích • Nulové pozadí

30. Stanovení bílkovin • Nezbytné pro posouzení specifické aktivity enzymu • Sledování průběhu purifikace enzymu • Nejčastějším standardním proteinem je hovězí sérový albumin • Stanovujeme celkové bílkoviny

31. Stanovení bílkovin Biuretová metoda Citlivost 1-20 mg / ml Interference: některé aminokyseliny, zwiterionty Lowryho metoda (595 nm) Citlivost 10 ug / ml Zdlouhavost (2kroky) Interference: ruší sulfát amonný., glycin, SH reagenty, EDTA > 0.1 mM Kombinace biuretové reakce a Folin-Ciocalteau reakce (zahrnuje reakce tyrosinových zbytků)

32. Stanovení bílkovin 562 nm Bicinchoninát Citlivost vysoká 1 ug / ml Pracná metoda – 2 kroky Interference: ruší EDTA, SH reagenty

33. Stanovení bílkovin Posun maxima Ze 465 na 595 nm Metoda podle Brafordové Citlivost vysoká 1 ug / ml Rychlá metoda (náročná na pečlivost) Interference: ruší Triton X-100, SDS, silně bazické pufry

34. Stanovení bílkovin Absorpce v UV oblasti (Tyr, Try) – 280 nm Citlivost 50 ug / ml Velmi rychlá metoda, nedestruktivní Interference: ruší NK, zákal e (ml/mg) BSA = 0,63 Ig = 1,38 Ovalbumin = 0,70 C (mg/ml) = A 280 C (mg/ml) = A280/e C (mg/ml) = 1,55.A280 – 0,76 A260

35. Sety pro stanovení enzymových aktivit • Výrazné zjednodušení stanovení • Obsahují všechny potřebné složky, včetně pufrů a standardů, a návod • Nejčastěji se využívá spektrofotometrie • Více než 100 druhů souprav

36. Automatické analyzátory • Analýza velkého množství vzorků • Až 40 analýz v jednom vzorku

37. Detekce amylasové aktivity Amylase (-) Amylase (+) Agarová plotna se zabudovaným škrobem Zaočkování testovanými organismy, kultivace Přelití jodovým roztokem (detekce nerozloženého škrobu) Jasné zóny indikujírozklad škrobu (amylasa positivní kmeny)

38. Substrátové desky • Skleněné desky pokryté tenkou vrstvou biopolymeru (zesítěná želatina, fibrin, škrob, dextran) • Využitelné pro detekci hydrolytických enzymů (proteasy, amylasy, dextranasy) • Použití: detekce enzymů ve frakcích po kapalinové chromatografii, v kultivačních médiích ...

39. Kde hledat informace? • Kompendium Methods of Enzymatic Analysis • Editor-in-Chief: Hans Ulrich Bergmeyer • Vydavatel: Verlag Chemie, Weinheim